Proteinase K mNGS (נוזל)
Proteinase K הוא פרוטאז סרין יציב עם סגוליות מצע רחבה.זה מפרק חלבונים רבים במצב הילידים אפילו בנוכחות חומרי ניקוי.עדויות ממחקרי גבישים ומבנה מולקולרי מצביעות על כך שהאנזים שייך למשפחת הסובטיליזינים עם טריאדה קטליטית באתר פעיל (Asp39-שֶׁלוֹ69-סר224).האתר השולט של הביקוע הוא הקשר הפפטיד הסמוך לקבוצת הקרבוקסיל של חומצות אמינו אליפטיות וארומטיות עם קבוצות אמינו אלפא חסומות.הוא משמש בדרך כלל בגלל הספציפיות הרחבה שלו.proteinase K זה תוכנן במיוחד עבור mNGS.בהשוואה לפרוטאינז K האחר, הוא מכיל אפילו פחות זיהום חומצת גרעין עם אותם ביצועים אנזימטיים, מה שיכול להבטיח טוב יותר את יישום mNGS במורד הזרם.
תנאי אחסון
2-8℃ למשך שנתיים
מִפרָט
| מראה חיצוני | נוזל חסר צבע עד חום בהיר |
| פעילות | ≥800 U/ml |
| ריכוז חלבון | ≥20 מ"ג/מ"ל |
| ניקאזה | אף אחד לא זוהה |
| DNase | אף אחד לא זוהה |
| RNase | אף אחד לא זוהה |
נכסים
| מספר EC | 3.4.21.64(רקומביננטי מאלבום Tritirachium) |
| נקודה איזואלקטרית | 7.81 |
| pH אופטימלי | 7.0- 12.0 איור 1 |
| טמפרטורה אופטימלית | 65 ℃ איור 2 |
| יציבות pH | pH 4.5-12.5 (25 ℃, 16 שעות) איור 3 |
| יציבות תרמית | מתחת ל-50 ℃ (pH 8.0, 30 דקות) איור 4 |
| יציבות אחסון | מעל 90% פעילות במשך 12 חודשים ב-25 ℃ |
| מפעילים | SDS, אוריאה |
| מעכבים | דיאיזופרופיל פלואורפוספט;פניל מתיל סולפוניל פלואוריד |
יישומים
1. ערכת אבחון גנטי
2. ערכות מיצוי RNA ו-DNA
3. מיצוי רכיבים שאינם חלבוניים מרקמות, פירוק זיהומי חלבון, כגון DNAחיסונים והכנת הפרין
4. הכנת DNA כרומוזום על ידי אלקטרופורזה פעימה
5. כתם מערבי
6. ריאגנטים של אלבומין עם גליקוזילציה אנזימטית במבחנה
אמצעי זהירות
ללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן בעת שימוש או שקילה, ולשמור היטב על אוורור לאחר השימוש.מוצר זה עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור ולגירוי חמור בעיניים.בשאיפה זה עלול לגרום לתסמיני אלרגיה או אסטמה או קוצר נשימה.עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה.
הגדרת יחידה
יחידה אחת (U) מוגדרת ככמות האנזים הדרושה להידרוליזה של קזאין לייצור 1 מיקרומולטירוזין לדקה בתנאים הבאים.
הכנת ריאגנטים
מגיב I: 1 גרם קזאין חלב הומס ב-50 מ"ל של תמיסת 0.1M נתרן פוספט (pH 8.0), הודגרה במים של 65-70 ℃ למשך 15 דקות, ערבב והומס, מקורר במים, כוון על ידי נתרן הידרוקסיד ל-pH 8.0 ונפח קבוע 100 מ"ל.
מגיב II: 0.1M חומצה טריכלורואצטית, 0.2M נתרן אצטט, 0.3M חומצה אצטית.
מגיב III: 0.4M Na2CO3פִּתָרוֹן.
מגיב IV: מגיב פורינט מדולל במים טהורים 5 פעמים.
מגיב V: מדלל אנזים: תמיסה של 0.1M נתרן פוספט (pH 8.0).
מגיב VI: תמיסת טירוזין: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml טירוזין מומס עם 0.2M HCl.
תהליך
1. 0.5 מ"ל מגיב I מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס, הוסף 0.5 מ"ל תמיסת אנזים, ערבב היטב ודגירה בשעה37℃ למשך 10 דקות.
2. הוסף 1 מ"ל מגיב II כדי לעצור את התגובה, ערבב היטב והמשך בדגירה למשך 30 דקות.
3. תמיסת תגובה צנטריפוגה.
4. קח סופרנטנט של 0.5 מ"ל, הוסף 2.5 מ"ל מגיב III, 0.5 מ"ל מגיב IV, ערבב היטב ודגור בטמפרטורה של 37℃למשך 30 דקות.
5. OD660נקבע כ-OD1;קבוצת ביקורת ריקה: 0.5 מ"ל מגיב V משמש להחלפת אנזיםפתרון לקביעת OD660בתור OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. עקומת תקן L-טירוזין: 0.5 מ"ל תמיסת L-טירוזין בריכוז שונה, 2.5 מ"ל מגיב III, 0.5 מ"ל מגיב IV בצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל, דגירה בטמפרטורה של 37℃ למשך 30 דקות, זיהוי OD660עבור ריכוז שונה של L-tyrosine, לאחר מכן התקבל העקומה הסטנדרטית Y=kX+b, כאשר Y הוא ריכוז L-tyrosine, X הוא OD600.
תַחשִׁיב
2: נפח כולל של תמיסת תגובה (מ"ל)
0.5: נפח תמיסת אנזים (מ"ל)
0.5: נפח נוזל תגובה בשימוש בקביעה כרומוגנית (מ"ל)
10: זמן תגובה (דקות)
Df: דילול מרובה
C: ריכוז אנזים (מ"ג/מ"ל)
הפניות
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. ויגר U & Hilz H. Biochem.ביופיס.מילוןCommun.(1971);44:513.
3. הילז, ה.וחב',יורוJ. Biochem.(1975);56:103–108.
4. סמברוק ג'ייet אל., שיבוט מולקולרי: מדריך מעבדה, מהדורה 2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
דמויות
תאנה.1 מֵיטָב pH
פתרון חיץ 100mM: pH6.0-8.0, Na-פוספט;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, גליצין-NaOH. ריכוז אנזים: 1mg/mL
איור 2 טמפרטורה אופטימלית
תגובה במאגר K-phosphate 20 מ"מ pH 8.0.ריכוז אנזים: 1 מ"ג/מ"ל
איור 3 pH יַצִיבוּת
25 ℃, טיפול של 16 שעות עם תמיסת חיץ של 50 mM: pH 4.5-5.5, אצטט;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, גליצין-NaOH.ריכוז אנזים: 1 מ"ג/מ"ל
איור 4 תרמית יַצִיבוּת
30 דקות טיפול עם חיץ Tris-HCl 50 מ"מ, pH 8.0.ריכוז אנזים: 1 מ"ג/מ"ל
איור 5 אחסון stability at 25℃
