RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase הוא פולימראז DNA תלוי תבנית RNA חסר פעילות 3'→5' exonuclease ויש לו פעילות RNase H.אנזים זה יכול להשתמש ב-RNA כתבנית לסינתזה של גדיל משלים של DNA, אותו ניתן ליישם על סינתזת cDNA של גדיל ראשון, במיוחד עבור RT-LAMP (הגברה איזותרמית בתיווך לולאה).בהשוואה ל-RTL reverse transcriptase 1.0, הרגישות משתפרת משמעותית, היציבות התרמית חזקה יותר והתגובה ב-65°C יציבה יותר.ניתן להשתמש ב-RTL הפוך טרנסקריפטאז (ללא גליצרול) להכנת תכשירים ליאופיל, ריאגנטים RT-LAMP ליאופיל וכו'.
הגדרת יחידה
יחידה אחת משלבת 1 ננומול של dTTP לתוך חומר הניתן לשקע חומצה תוך 20 דקות ב-50 מעלות צלזיוס באמצעות poly(A)•oligo(dT)25 כ-template-primer.
רכיבים
| רְכִיב | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (ללא גליצרול) (15U/μL) | 0.1 מ"ל | 1 מ"ל | 10 מ"ל |
| מאגר 10×HC RTL | 1.5 מ"ל | 4×1.5 מ"ל | 5×10 מ"ל |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 מ"ל | 2×1.5 מ"ל | 3×10 מ"ל |
מצב אחסון
הובלה מתחת ל-0°C ולאחסן ב-25°C~-15°C.
בקרת איכות
- פעילות שיורית שלEndonuclease:תגובה של 50 μL המכילה 1 מיקרוגרם של λDNA ו-15 יחידות של RTL2.0 שהודגרו במשך 16 שעות ב-37 ℃ מראה את אותו דפוס כמו בקרה שלילית על ידי אלקטרופורזה בג'ל.
- פעילות שיורית שלExonuclease:תגובה של 50 μL המכילה 1 מיקרוגרם של Hind Ⅲ מעוכל λDNA ו-15 יחידות של RTL2.0 שהודגרו במשך 16 שעות ב-37 ℃ מציגה דפוס זהה לשליטה שלילית על ידי אלקטרופורזה ג'ל.
- פעילות שיורית שלניקאזה:תגובה של 50 μL המכילה 1 מיקרוגרם של pBR322 מפותל ו-15 יחידות של RTL2.0 שהודגרו במשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס מראה את אותו דפוס כמו בקרה שלילית על ידי אלקטרופורזה בג'ל.
- פעילות שיורית שלRNase:תגובה של 10 μL המכילה 0.48 מיקרוגרם של MS2 RNA ו-15 יחידות של RTL2.0 שהודגרו במשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס מראה את אותו דפוס כמו בקרה שלילית על ידי אלקטרופורזה בג'ל.
- אי - קולי gDNA:נמדד עםאי - קוליערכות זיהוי HCD ספציפיות, 15 יחידות של RTL2.0 מכילות פחות מ-1אי - קוליגנום.
הגדרת תגובה
פרוטוקול סינתזה של cDNA
| רכיבים | כרך |
| תבנית RNA א | אופציונאלי |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) או תערובת פריימר אקראית (60uM) | 2 μL |
| מיקס dNTP (10 מ"מ כל אחד) | 1 μL |
| מעכב RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| מאגר 10×HC RTL | 2 μL |
| מים ללא נוקלאז | עד 20 μL |
הערות:
1) המינון המומלץ של Total RNA הוא 1ng ~ 1μg
2) המינון המומלץ של mRNA היה 50ng~100ng
תרמו-רכיבה על אופניים תנאים לשגרה תְגוּבָה:
| טמפרטורה (°C) | זְמַן |
| 25 מעלות צלזיוסa | 5 דקות |
| 55 מעלות צלזיוס | 10 דקותb |
| 80 מעלות צלזיוס | 10 דקות |
הערות:
1) אם נעשה שימוש במיקס פריימר אקראי, שלב דגירה ב-25°C.
2) אם נעשה שימוש בתערובת פריימר מטרה, שלב דגירה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 ~ 30 דקות.
פרוטוקול RT-LAMP
| רכיבים | כרך | ריכוז סופי |
| תבנית RNA | אופציונאלי | ≥10 עותקים |
| מיקס dNTP (10mM) | 3.5 μL | 1.4 מ"מ |
| פריימרים FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1.6 מיקרומטר |
| פריימרים F3/B3 (25×) | 1 μL | 0.2 מיקרומטר |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 מיקרומטר |
| מעכב RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/תגובה |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/תגובה |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/תגובה |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 מ"מ (סה"כ 8 מ"מ) |
| מאגר 10×HC RTL (או 10×HC Bst V2 מאגר) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| מים ללא נוקלאז | עד 25 μL | - |
הערות:
1) מערבבים על ידי מערבולת וצנטריפוגה קצרות לאיסוף.דגירה בטמפרטורה קבועה ב-65 מעלות צלזיוס למשך שעה.
2) שני המאגרים ניתנים להפעלה הדדית ובעלי אותו הרכב.
הערות
1. מוצר זה יוצר מוצק לבן כאשר הוא מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס.הוצא אותו מ-20 מעלות צלזיוס והניח אותו על קרח למשך כ-10 דקות.לאחר ההמסה, ניתן להשתמש בו על ידי ניעור וערבוב.
2. ניתן לאחסן את מוצר ה-cDNA ב-20°C או -80°C או להשתמש בו מיד לתגובת PCR.
3. כדי למנוע זיהום RNase, נא לשמור על אזור הניסוי נקי וללבוש כפפות ומסכות נקיות במהלך הפעולה.
