5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
מספר חתול: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) הוא תערובת יציבה ביותר המבוססת על צינורית אחת המתאימה לשעתוק הפוך בשלב אחד ו-PCR כמותי (qRT-PCR).הוא תומך בערבוב מוקדם של פריימרים ובדיקות ונשאר יציב לאחר אחסון זמן רב בטמפרטורה נמוכה.ניתן להוסיף את הדגימה לבדיקה ישירות בעת השימוש, ללא פעולת פתיחה/פיפטציה נוספת של הצינור.מוצר זה מספק רכיבים, כגון DNA פולימראז עם התחלה חמה, M-MLV, אורציל DNA glycosylase (TS-UNG) בעל רגישות לחום, מעכב RNase, MgCl2, dNTPs (עם dUTP במקום dTTP), ומייצבים.עם ה-Reverse Transcriptase של ההגברה המהירה המהונדסת גנטית ו-DNA פולימראז, ניתן להשלים את הגברה של PCR תוך 20-40 דקות.מגיב זה משתמש במאגר מיוחד עבור qPCR עם אנזימים מעורבים של אנזים הגברה אנטי-מעכב ואנזים UNG.לכן, הוא יכול להשיג הגברה טובה של גני מטרה ולמנוע הגברה שווא הנגרמת על ידי זיהום שיורי PCR ואירוסולים.מגיב זה תואם לרוב מכשירי ה-PCR הכמותיים הקרינה מיצרנים כגון Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad ו-Roche.
רְכִיב
1.25× Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5× Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
תנאי אחסון
יש לשמור את כל הרכיבים ב-20℃ לאחסון לטווח ארוך ו-4℃ עד 3 חודשים.נא לערבב ביסודיות לאחר ההפשרה ולצנטריפוגה לפני השימוש.הימנע מהקפאה-הפשרה תכופה.
הכנת מערכת תגובה qRT-PCR
| רכיבים | 25μLמערכת | 50μLמערכת | ריכוז סופי |
| 5× Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25× Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1μL | 2μL | 1× |
| תבנית RNAb | – | – | – |
| ddH2O | עד 25μL | עד 50μL | – |
1) א. הריכוז הסופי של הפריימר הוא בדרך כלל 0.2μM.לתוצאות טובות יותר, ניתן לייעל את ריכוז הפריימר בטווח של 0.2-1μM.באופן כללי, ניתן לייעל את ריכוז הבדיקה בטווח של 0.1-0.3μM.
2) ב.בשימוש בהליך PCR מהיר, הגדלת ריכוז הפריימרים והפרובים עשויה להביא לתוצאות הגברה טובות יותר, ויש לייעל את היחס ביניהם בהתאם.
3) סוגים שונים של דגימות מכילים סוגים ותוכן שונים של מעכב ומספר העתק של גן המטרה.יש לשקול את נפח הדגימה לפי המצב בפועל.בצע דילול של הדגימה עם מים נטולי נוקלאז או TE Buffer, במידת הצורך.
תגובה גתנאים
| הליך PCR רגיל | הליך PCR מהיר | ||||||
| תהליך | טמפ' | זְמַן | מחזור | תהליך | טמפ' | זְמַן | מחזור |
| תמלול הפוך | 50℃ | 10-20 דקות | 1 | תמלול הפוך | 50℃ | 5 דקות | 1 |
| פולימראז הַפעָלָה | 95℃ | 1-5 דקות | 1 | פולימראז הַפעָלָה | 95℃ | שנות ה-30 | 1 |
| דנטורציה | 95℃ | 10-20 שניות | 40-50 | דנטורציה | 95℃ | 1-3 שניות | 40-50 |
| רִכּוּך ו סיומת | 56-64℃ | שנות ה-20-60 | רִכּוּך ו סיומת | 56-64℃ | 3-20 שניות | ||
בקרת איכות
1.זיהוי פונקציות: רגישות, ספציפיות וחזרה של qPCR.
2.ללא פעילות נוקלאז אקסוגנית: ללא אנדונוקלאז אקסוגני וזיהום אקסוגני.
הערות
1.קצב ההגברה של פולימראז DNA מהיר הוא לא פחות מ-1kb/10s.למכשירי PCR שונים יש מהירויות חימום וקירור שונות, מצבי בקרת טמפרטורה ומוליכות תרמית, ולכן חיוני אופטימיזציה של ריכוז ה-primer/probe ושיטת הריצה בשילוב עם מכשיר ה-PCR המהיר הספציפי שלך.
2.מוצר זה מבצע ישימות רחבה, והוא מתאים לאבחון מולקולרי ברגישות גבוהה.שיטת PCR תלת-שלבית מומלצת עבור פריימרים עם טמפרטורת חישול נמוכה או להגברה של שברים ארוכים מעל 200 bp.
3.מכיוון שלאמפליקונים שונים יש יעילות ניצול שונה של dUTP ורגישות שונה ל-UNG, יש לבצע אופטימיזציה של הריאגנטים אם רגישות הזיהוי יורדת בעת שימוש במערכת UNG.אנא צור איתנו קשר לקבלת תמיכה טכנית במידת הצורך.
4.כדי למנוע הגברה של מוצרי PCR העברה, יש צורך בשטח ניסוי ייעודי ובפיפטה להגברה.הפעל עם כפפות והחלף לעתים קרובות ואל תפתח את צינור ה-PCR לאחר ההגברה.
