Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (שינוי נוגדן) הוא פולימראז DNA יציב להתחלה חמה מבית Thermus aquaticus YT-1, בעל פעילות פולימראז של 5′→3′ ופעילות אנדונוקלאז של 5'.פולימראז ה-Taq DNA עם התחלה חמה הוא פולימראז של Taq DNA אשר שונה על ידי נוגדני Taq תרמי.שינוי נוגדנים הגביר את הספציפיות, הרגישות והתשואה של PCR.
רכיבים
| רְכִיב | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq Buffer | 4×1 מ"ל | 4×10 מ"ל | 4×50 מ"ל | 5×400 מ"ל |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (נוגדן שונה) (5 U/μL) | 0.1 מ"ל | 1 מ"ל | 5 מ"ל | 10×5 מ"ל |
יישומים
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 ב-25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 ו-50% Glycerol.
מצב אחסון
הובלה מתחת ל-0°C ולאחסן ב-25°C~-15°C.
הגדרת יחידה
יחידה אחת מוגדרת ככמות האנזים המשלבת 15 ננומול של dNTP בחומר בלתי מסיס בחומצה תוך 30 דקות ב-75 מעלות צלזיוס.
בקרת איכות
1.Endפעילות onuclease:דגירה של 20 U של אנזים עם 4 מיקרוגרם pUC19 DNA במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37℃ הובילה לפירוק לא ניתן לזיהוי של ה-DNA כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה ג'ל.
2.5 kb למבדה PCR:25 מחזורים של הגברה של PCR של 5 ng Lambda DNA עם 1.25 יחידות של Taq DNA Polymerase בנוכחות 200 µM dNTPs ו-0.2 µM פריימרים מביאים לתוצר הצפוי של 5 kb.
3.פעילות Exonuclease:דגירה של תגובה של 50 μl המכילה מינימום של 12.5 U של Taq DNA Polymerase עם 10 nmol 5´-FAM אוליגונוקלאוטיד למשך 30 דקות ב-37℃ אינה מניבה פירוק שניתן לזהות.
4.פעילות RNase:דגירה של תגובה של 10 μL המכילה 20 U של אנזים עם 1μg של תעתיקי RNA למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס לא הביאה לפירוק בר זיהוי של ה-RNA כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה ג'ל.
5.השבתת חום:לא.
מערכת תגובה
| רכיבים | כרך |
| תבנית DNAa | אופציונאלי |
| פריימר קדימה 10 מיקרומטר | 0.5 μL |
| פריימר הפוך 10 מיקרומטר | 0.5 μL |
| מיקס dNTP (10 מ"מ כל אחד) | 0.5 μL |
| 5×HC Taq Buffer | 5 μL |
| Taq DNA Polymeraseב(5U/μL) | 0.125 μL |
| מים ללא נוקלאז | עד 25 μL |
הערות:
1) א.
| DNA | כמות |
| גנומי | 1 ng-1 מיקרוגרם |
| פלסמיד או ויראלי | 1 pg-1 ng |
2) ב.הריכוז האופטימלי של Taq DNA Polymerase עשוי לנוע בין 5-50 יחידות/מ"ל (0.1-0.5 יחידות/תגובה של 25 μL) ביישומים מיוחדים.
פרוטוקול רכיבה תרמית
PCR
| שלב | טֶמפֶּרָטוּרָה(מעלות צלזיוס) | זְמַן | מחזורים |
| דנטורציה ראשוניתa | 95 ℃ | 1-3 דקות | - |
| דנטורציה | 95 ℃ | 15-30 שניות | 30-35 מחזורים |
| רִכּוּךב | 45-68 ℃ | 15-60 שניות | |
| סיומת | 68 ℃ | 1kb/min | |
| הרחבה סופית | 68 ℃ | 5 דקות | - |
הערות:
1) דנטורציה ראשונית של דקה אחת ב-95 מעלות צלזיוס מספיקה לרוב ההגברות.עבור תבניות קשות, מומלץ דנטורציה ארוכה יותר של 2-3 דקות ב-95°C.עם PCR של מושבה, מומלץ דנטורציה ראשונית של 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
2) שלב החישול הוא בדרך כלל 15-60 שניות.טמפרטורת החישול מבוססת על ה-Tm של זוג הפריימר והיא בדרך כלל 45-68℃.
