מעכב רנאס
Inhibitor Murine RNase הוא מעכב RNase של עכברים רקומביננטי המתבטא ומטוהר מ-E.coli.הוא נקשר ל-RNase A, B או C ביחס של 1:1 באמצעות קשר לא קוולנטי, ובכך מעכב את פעילות שלושת האנזימים ומגן על RNA מפני פירוק.עם זאת, זה לא יעיל נגד RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H או RNase מאספרגילוס.מעכב RNase Murine נבדק על ידי RT-PCR, RT-qPCR ו-IVT mRNA, והיה תואם למגוון מסחרי של Reverse transcriptases, DNA פולימראזות ו-RNA פולימראזות.
בהשוואה למעכבי RNase אנושיים, מעכב RNase של עכברים אינו מכיל שני ציסטינים הרגישים מאוד לחמצון הגורם לחוסר הפעלה של המעכב.זה מה שהופך אותו ליציב בריכוזים נמוכים של DTT (פחות מ-1 מ"מ).תכונה זו הופכת אותו למתאים לשימוש בתגובות שבהן ריכוזים גבוהים של DTT פוגעים בתגובה (למשל RT-PCR בזמן אמת).
Aיישום
ניתן להשתמש במוצר זה באופן נרחב בכל ניסוי שבו התערבות RNase אפשרית כדי למנוע פירוק RNA, כגון:
1.סינתזה של הגדיל הראשון של cDNA, RT-PCR, RT-qPCR וכו'.
2.מגן על RNA מפני פירוק במהלך שעתוק/תרגום חוץ גופית (למשל, מערכת שכפול ויראלית חוץ גופית).
3.עיכוב פעילות RNase במהלך הפרדה וטיהור RNA.
תנאי אחסון
ניתן לאחסן את המוצר ב--25～- 15 ℃, תקף לשנתיים.
מאגר אחסון
50 מ"מ KCl, 20 מ"מ HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 מ"מ DTT ו-50% גליצרול.
הגדרת יחידה
הכמות של מעכב RNase של עכברים הדרושה כדי לעכב את הפעילות של 5ng של ribonuclease A ב-50% הוגדרה כיחידה אחת (U).
משקל מולקולרי של חלבון
המשקל המולקולרי של מעכב RNase של עכברים הוא 50 kDa.
בקרת איכות
Exonuclease פעילות:
40 U של מעכב RNase של עכברים עם 1 מיקרוגרם λ -Hind III עיכול DNA בטמפרטורה של 37℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.
פעילות אנדונוקלאז:
40 U של מעכב RNase של עכברים עם 1μ גרם λ DNA בטמפרטורה של 37℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.
ניקינג פעילות:
40U של מעכב RNase של עכברים עם 1μ גרם pBR322 בטמפרטורה של 37℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.
RNase פעילות:
40U של מעכב RNase של עכברים עם 1.6μ גרם MS2 RNA למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37℃ לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.
E.coli DNA:
40 U של מעכב RNase של עכברים נבדקים עבור נוכחות של DNA גנומי מסוג E. coli באמצעות TaqMan qPCR עם פריימרים ספציפיים ללוקוס rRNA של E. coli 16S.זיהום ה-DNA הגנומי של E. coli הוא ≤ 0.1 pg/40 U.
Nהערהs
1. תנודה או ערבוב אלים יובילו להשבתת האנזים.
2. טווח הטמפרטורות האופטימלי של המעכב הזה היה 25-55 ℃, והוא הושבת ב 65 ℃ ומעלה.
3. הפעילויות של RNase H, RNase 1 ו-RNase T1 לא עוכבו על ידי מעכב RNase של עכברים.
4. העיכוב של פעילות RNase נמצא בטווח רחב של pH (pH 5-9 היו פעילים כולם), והפעילות הגבוהה ביותר נצפתה ב-pH 7-8.
5. מאחר ריבונוקלאזים בדרך כלל שומרים על פעילות בתנאי דנטורציה, יש להקפיד להימנע מדנטורציה של מולקולות מעכבי RNase אשר התחברו לריבונוקלאז.כדי למנוע שחרור של ribonuclease פעיל, יש להימנע מטמפרטורות גבוהות מ-50 מעלות צלזיוס וריכוזים גבוהים של אוריאה או חומרי דנטורציה אחרים.
