ערכת PCR ישירה לצמח
מספר חתול: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit מתאימה להגברה ישירה של עלי צמחים, זרעים וכו', וניתן להשתמש בה להקרנה בתפוקה גבוהה של דגימות צמחים שאינן מכילות פוליסכרידים ופוליפנולים.לפולימראז ה-DNA ההגברה הישירה המבוססת על האבולוציה המכוונת יש סבילות עדיפה למעכבי PCR בצמחים.בינתיים, הוא שומר על ביצועי ההגברה הגבוהים, המתאימים להגברה של שברי DNA בטווח של 5 קילובייט.ניתן להשתמש ב-Lysis buffer A הייחודי בערכה לליזה של רקמות צמחים טריות או קפואות.זה קל לתפעול והליסאט יכול לשמש כתבנית להגברה ללא טיהור.המערכת מכילה חומרי הגנה המאפשרים להגביר ביעילות דגימות גולמיות לאחר הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.2 × Plant Direct Master Mix צריך להוסיף רק פריימרים ותבניות כדי לבצע תגובת הגברה, ובכך להפחית את פעולות הפיפטינג ולשפר את תפוקת הזיהוי ושחזור התוצאות.
רכיבים
| רכיבים | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2× Plant Direct Master Mix | 1.25 מ"ל | 4×1.25 מ"ל |
| צמח ליסיס ישיר מאגר A | 5 מ"ל | 20 מ"ל |
| מאגר ליזה ישיר לצמח B* | 5 מ"ל | 20 מ"ל |
*Plant Lysis Buffer B הוא מגיב אופציונלי, המשמש לנטרול Plant Direct Lysis Buffer A להארכת זמן האחסון של דגימות.ניתן להשתמש בו בהתאם למצב בפועל.
תנאי אחסון
2 × Plant Direct Master Mix, אחסן ב-30 ~ -15℃ והימנע מהקפאה והפשרה חוזרת;צמח מאגר ליסיס ישיר, אחסן ב-30 ~ -15 ℃ או 2 ~ 8 ℃.
תהליך ניסוי
עיבוד לדוגמא–עלה צמחי
שיטה ישירה:מומלץ להשתמש בעלים צעירים.השתמש באגור חור בקוטר קבוע של 0.5 - 3 מ"מ כדי לקבל דגימה קטנה ואחידה, ולאחר מכן הוסף ישירות את הדגימה למערכת ה-PCR (מומלצת מערכת 50 μl).שימו לב, ודא שהדגימה נמצאת בתמיסת ה-PCR ולא מול דופן הצינור.אם נעשה שימוש ב-PCR ישיר להגברת שברים ארוכים ודגימות מורכבות, שימוש בדגימה בקוטר קטן יותר (0.5 - 1 מ"מ) כתבנית יכול לעזור להשיג תוצאות טובות יותר.
שיטת תמוגה טחינה:מומלץ להשתמש בעלים צעירים.קח חתיכה קטנה של עלה (בערך 1 - 3 מ"מ קוטר), הנח אותה ב-20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, וטחנת אותו ככל האפשר (שלב זה יכול להיעשות על ידי סחיטת העלה עם קצה פיפטה 100 μl למעוך את המדגם).אם נעשה שימוש בנפחים גדולים יותר של רקמת עלים (לא יעלה על 7 מ"מ), הגדל את נפח חיץ הדילול ל-50 μl.לאחר טחון העלים, התמיסה אמורה להיראות ירוקה.לאחר צנטריפוגה קצרה, הוסף 1 μl מהסופרנטנט למערכת ה-PCR כתבנית תגובה.
שיטת תמוגה תרמית:מומלץ להשתמש בעלים צעירים.קח חתיכה קטנה של עלה (בערך 1 - 3 מ"מ קוטר), הנח אותה ב-20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, וחמם אותו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 דקות.ניתן להאריך כראוי את זמן הליזה עבור עלים שקשה לליטוש (לא יותר מ-20 דקות).אם נעשה שימוש בנפחים גדולים יותר של רקמת עלים (לא יעלה על 7 מ"מ), הגדל את נפח חיץ הדילול ל-50 μl.לאחר החימום, צנטריפוגה קצרות והוסיפו 1 μl של supernatant למערכת ה-PCR כתבנית תגובה.
עיבוד לדוגמא-זרע צמחי
שיטת תמוגה טחינה:השתמש באזמל כדי לחתוך זרעים בקוטר של 5 מ"מ, הוסף אותם ל-100 μl של מאגר ליסיס ישיר של צמח A, וטוחן את הדגימה עם קצה פיפטה או כלים אחרים.מערבלים קצרות ומניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.ודא שדגימת הזרע שקועה במאגר הדילול.לאחר צנטריפוגה קצרה, הוסף 1 μl מהסופרנטנט למערכת ה-PCR כתבנית תגובה.
שיטת תמוגה תרמית:השתמש באזמל כדי לחתוך זרעים בקוטר של 5 מ"מ, הוסף אותם ל-100 μl של מאגר ליסיס ישיר של צמח A, וחמם ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 דקות.ניתן להאריך כראוי את זמן הליזה עבור עלים שקשה לליטוש (לא יותר מ-30 דקות).לאחר החימום, צנטריפוגה קצרות והוסף 1 μl supernatant למערכת ה-PCR כתבנית תגובה.
א.ניתן להשתמש במספריים או בכלים אחרים כדי לחתוך דוגמאות בגודל מתאים;אם האגרוף או המספריים נמצאים בשימוש חוזר, יש לנקות אותם בתמיסת נתרן היפוכלוריט 2% לפני כל שימוש כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות.
ב.ודא שמאגר הליסיס הישיר של הצמח נמס במלואו לפני השימוש.אם המאגר צמיג או בעל משקעים, ניתן לחמם אותו ב-37℃ כדי להמיס אותו לחלוטין לפני השימוש.
ג.ניתן להתאים את נפח התבנית במערכת התגובה בהתאם להבדל בנפח החומר הצמחי והמדלל שנוספו.
צמח מאגר ליסיס ישיר
מאגר ליסיס ישיר לצמח A הכלול במוצר זה עבר אופטימיזציה קפדנית לשחרור הגנום של רוב רקמות הצמח והוא מתאים לאחסון לטווח קצר של צמחים גולמיים בטמפרטורה של 4℃.אם יש לאחסן את הדגימה לפרק זמן ארוך יותר (למשל 1-2 חודשים), מומלץ להעביר את הסופרנטנט לצינור EP חדש ולאחסן אותו ב-20℃.כדי לאחסן את הדגימות בצורה יציבה יותר, הוסף נפח שווה של Plant Direct Lysis Buffer B לסופרנטנט המועבר, ערבב היטב ואחסן ב-20℃.זמן האחסון היציב משתנה בהתאם לדגימות ומצבי הצמח.
מערכת תגובה
| ddH2O | עד 20.0 µl | עד 50.0 µl |
| 2× Plant Direct Master Mixa | 10.0 µl | 25.0 מיקרומטר |
| פריימר 1 (10 מיקרומטר) | 0.8 μl | 2.0 µl |
| פריימר 2 (10 מיקרומטר)b | 0.8 μl | 2.0 µl |
| דגימת עלה צמח/תמצית גולמית(עיין בעיבוד לדוגמה) | 0.5 - 3 מ"מ דיסק עלים/x µl | 0.5 - 3 מ"מ דיסק עלים/x µl |
א.הוא מכיל Mg2+בריכוז סופי של 2 מ"מ.
ב.מומלץ להשתמש בריכוז סופי של 0.4μM עבור כל פריימר.שימוש מופרז בפריימרים יוביל להגברה לא ספציפית.
ג.ניתן להתאים את כמות המדגם בשימוש בהתאם למצב בפועל.ניתן להתאים את הכמות המשמשת בתגובה בודדת של מדגם גולמי גולמי בין 2% - 20% מהנפח הכולל של התגובה.שימוש ביותר מדי דגימות עלול לגרום לכשל בהגברה.
תוכנית תגובה
| שלבים | טֶמפֶּרָטוּרָה | זְמַן |
| דנטורציה ראשונית | 98℃ | 5 דקות |
| דנטורציה | 95℃ | 10 שניות |
| רִכּוּך | 58 ~ 72℃ | 15 שניות |
| סיומת | 72℃ | 30 שניות |
| הרחבה סופית | 72℃ | 5 דקות |
א.דנטורציה ראשונית (98℃, 5 דקות) מקדמת תמוגה של רקמת צמחים, משחררת DNA גנומי שניתן להשתמש בו להגברת PCR.אין לקצר את הזמן או להוריד את הטמפרטורה.
ב.מומלץ להגדיר אותו שווה לערך ה-primer Tm או גבוה ב-2 ~ 4℃ מערך Tm.פולימראז ה-DNA ההגברה הישירה המשמש במוצר זה שונה מפולימראז ה-DNA הרגיל של Taq, ויש לו דרישות מיוחדות לטמפרטורת חישול התגובה; השימוש בטמפרטורת חישול גבוהה יכול למעשה להפחית הגברה לא ספציפית ולשפר את יעילות ההגברה.עבור תבניות מורכבות, ניתן להשיג את ההגברה היעילה על ידי התאמת טמפרטורת החישול והארכת זמן הארכה.
ג.אם אורך תוצר ההגברה הוא ≤1 kb, זמן הארכה מוגדר ל-30 שניות/kb;אם אורך מוצר ההגברה הוא > 1 kb, זמן הארכה מוגדר ל-60 שניות/kb.
ד.עבור דגימות מורכבות או דגימות עם תפוקת הגברה נמוכה, ניתן להגדיל את מספר המחזורים כראוי ל-40 -50 מחזורים.
יישומים
זה ישים להגברה ישירה של רקמות צמחיות והקרנה בתפוקה גבוהה של דגימות צמחים שאינן מכילות פוליסכרידים ופוליפנולים.
הערות
לשימוש מחקר בלבד.לא לשימוש בהליכי אבחון.
1. להגברת צמחים גולמית או הגברה ישירה, מומלץ להשתמש ב-DNA גנומי מטוהר כבקרה חיובית לפני תחילת הניסוי כדי לוודא שהמערכת, הפריימרים והפעולות נכונות.
2. לפולימראז DNA הגברה ישיר המשמש בערכה זו פעילות הגהה חזקה.אם יש צורך לבצע שיבוט TA, מומלץ לטהר את ה-DNA לפני הוספת האדנין.
3. הנחיות לעיצוב פריימר:
א.מומלץ שהבסיס האחרון בקצה 3′ של הפריימר יהיה G או C.
ב.יש להימנע מחוסר התאמה רצוף ב-8 הבסיסים האחרונים בקצה 3′ של הפריימר.ג.הימנע ממבנים סיכות ראש בקצה 3' של הפריימר.
ד.הבדלים בערך ה-Tm של הפריימר קדימה והפריימר לאחור צריכים להיות לא יותר מ-1℃ ויש להתאים את ערך ה-Tm ל-60 ~ 72℃ (מומלץ לחשב את ערך ה-Tm של Primer Premier 5).
ה.אין לכלול רצפי פריימר נוספים שאינם מתאימים לתבנית בעת חישוב ערך ה-primer Tm.
ו.מומלץ שתכולת GC של הפריימר תהיה 40% -60%.
ז.ההתפלגות הכוללת של A, G, C ו-T בפריימר צריכה להיות אחידה ככל האפשר.הימנע משימוש באזורים עם תכולת GC או AT גבוהה.
ח.הימנע מנוכחות של רצפים משלימים של 5 או יותר בסיסים בתוך הפריימר או בין שני פריימרים והימנע מנוכחות של רצפים משלימים של 3 או יותר בסיסים בקצה 3′ של שני פריימרים.
אני.השתמש בפונקציה NCBI BLAST כדי לבדוק את הספציפיות של הפריימר כדי למנוע הגברה לא ספציפית.
