ערכת מיני מיצוי DNA
ערכה זו מאמצת מערכת חיץ אופטימלית וטכנולוגיית טיהור עמודת סיליקה ג'ל, שיכולה לשחזר שברי DNA של 70 bp - 20 kb מריכוזים שונים של TAE או TBE agarose gel.עמודת ספיחה של DNA יכולה לספוג DNA במיוחד בתנאי מלח גבוהים.בנוסף, הערכה יכולה לטהר ישירות שברי DNA ממוצרי PCR, מערכות תגובה אנזימטיות או מוצרי DNA גולמיים המתקבלים בשיטות אחרות, ולהסיר זיהומים כגון חלבונים, תרכובות אורגניות אחרות, יוני מלחים אנאורגניים ופריימרים של אוליגונוקלאוטידים.זה יכול להבטיח שניתן להשלים את הטיהור תוך 10-15 דקות.ניתן להשתמש ב-DNA המטוהר ישירות לקשירה, טרנספורמציה, עיכול אנזים, שעתוק במבחנה, PCR, רצף, הזרקת מיקרו וכו'.
תנאי אחסון
אחסן ב -15 ~ -25 ℃ והובל בטמפרטורת החדר.
רכיבים
| רכיבים | (100 rxns) |
| תמ"ג מאגר | 80 מ"ל |
| Buffer GW | 2 × 20 מ"ל |
| מאגר שחרור | 20 מ"ל |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
תמ"ג מאגר:חיץ מקשר ל-DNA.
מאגר GW:חיץ כביסה;הוסף אתנול מוחלט לפי הנפח המצוין על הבקבוק לפני השימוש.
מאגר שחרור:שחרור.
FastPure DNA Mini Columns-G:עמודות ספיחה של DNA.
צינורות איסוף 2 מ"ל:צינורות איסוף לתסנן.
חומרים מוכנים
1.5 מ"ל צינורות מעוקרים, אתנול מוחלט ואיזופרופנול (כאשר קטע DNA ≤100 bp, הוסף נפח אחד
isopropanol לנפח 1 ג'ל), אמבט מים.
תהליך ניסוי
הוסף 80 מ"ל של אתנול כדי לדלל Buffer GW כפי שמצוין בתג לפני השימוש, אחסן בטמפרטורת החדר.
מַנגָנוֹן
1. תמיסת תגובת PCR
ערכת מיצוי ג'ל: הוסף כמות שווה של Buffer GDP ערכת תגובת תגובת PCR לשחזור:הוסף פי 5 מאגר נפח
2. GDP חשב את נפח הג'ל (100 μl שווה 100 מ"ג)
ממיסים ג'ל
3. מחממים מראש ל-50 ~ 55℃
4. לאגד שטיפה
הוסף 300 μL של תמ"ג מאגר*
הוסף 700 μL של Buffer GW
הוסף 700 μL של Buffer GW
5. אלוט
הוסף 20 - 30μL של מאגר Elution או מים מפושטים
הערות* התאוששות נוזל תגובה PCR ללא שלב זה
תוכנית מיצוי ג'ל
1. לאחר אלקטרופורזה של DNA לפירוק שברי DNA, כרות את הפס הבודד של שבר ה-DNA מג'ל אגרוז תחת אור UV.מומלץ להשתמש בנייר סופג לספיגת הלחות הנראית של הג'ל ולמזער את גודל פרוסת הג'ל על ידי הסרת עודף אגרוז ככל האפשר.שקלו את פרוסת הג'ל (ללא צינורית מיקרוצנטריפוגה) כדי לחשב את נפחו: נפח של 100 מ"ג ג'ל הוא כ-100 μL, בהנחה שהצפיפות היא 1g/ml.
2. הוסף נפח שווה ערך Buffer GDP, דגירה ב-50~55℃ למשך 7-10 דקות (בהתאם לגודל הג'ל, התאם את זמן הדגירה עד להמסה מלאה של הג'ל).הפוך את הצינור 2 פעמים במהלך הדגירה.
Δ תוספת של 1-3 נפחים של Buffer GDP לא תשפיע על יעילות שחזור ה-DNA.אם קטע ה-DNA שיש לשחזר <100 bp, יש להוסיף 3 כרכים של Buffer GDP;כאשר פרוסת הג'ל נמסה לחלוטין, הוסיפו נפח אחד של איזופרפנול וערבבו היטב, ואז המשיכו לשלב הבא.
3. צנטריפוגה קצרה כדי להביא את הדגימה לתחתית הצינור, הכנס את FastPure DNA Mini Columns-G לתוך צינורות האיסוף 2 מ"ל, העביר בזהירות את התמיסה מקסימום של 700 μL פעם אחת
זמן לעמודות הסינון, צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (13,800 Xg) למשך 30-60 שניות.
4. השליכו את התסנין והוסיפו 300 μL של Buff GDP לעמודה, הדגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (13,800 Xg) למשך 30-60 שניות.
5. השליכו את התסנין והוסיפו 700 μL של Buffer GW (בדוק אם אתנול מוחלט נוסף מראש!) לעמודה, צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (13,800 Xg) למשך 30-60 שניות.
Δ נא הוסף Buffer GW סביב דופן עמוד הספיחה, או הוסף את המכסה האחורי של Buffer GW וערבב אותו הפוך 2 - 3 פעמים כדי לעזור לשטוף לחלוטין את המלח הנדבק לקיר הצינור.
6. חזור על שלב 5.
Δ שטיפה עם Buffer GW פעמיים יכולה להבטיח שהמלח יוסר לחלוטין ולבטל את ההשפעה על הניסויים הבאים.
7. השליכו את התסנין וצנטריפוגה את העמודה הריקה ב-12,000 סל"ד (13,800 X גרם) למשך 2 דקות.
8. הכנס את העמודה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה נקייה של 1.5 מ"ל, הוסף 20 - 30 μL של Buffer Elution למרכז קרום העמודה, דגירה למשך 2 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (13,800 Xg) למשך דקה.השליכו את העמודה, אחסנו את ה-DNA שהתקבל ב-20-.
Δ העברת הסופרנטנט של שלב 8 לעמודה כדי לחלוט שוב וחימום מראש של מאגר ה-Elution ל-55 (כאשר מקטע DNA>3 kb) עשוי לעזור להגביר את יעילות ההתאוששות.
תוכנית שחזור מוצרי PCR
פרוטוקול זה ישים לטיהור שברי DNA ממוצרי PCR, מערכת תגובה אנזימטית ומוצרי DNA גולמיים אחרים (כולל DNA גנטי).פתרון זה יכול להסיר ביעילות נוקלאוטידים שונים, פריימרים, דימרי פריימר, מולקולות מלח, אנזימים וזיהומים אחרים.
1. צנטריפוגה בקצרה מוצרי PCR, תמיסת תגובה אנזימטית ומוצרי DNA גולמיים אחרים.העריכו את נפחם בעזרת פיפטה והעבירו לשפופרת מעוקרת של 1.5 מ"ל או 2 מ"ל.הוסף ddH2O עד נפח עד 100 μL;בעוד עבור DNA גנומי עם ריכוז גבוה, דילול ל-300 μL עם ddH2O יעזור לשפר את יעילות ההתאוששות.
2. הוסף 5 נפחים של Buffer GDP, ערבב ביסודיות על ידי היפוך או מערבולת.אם קטע DNA מעניין מעל 100 bp, יש להוסיף נפחים נוספים של 1.5 (דגימות + Buff GDP) של אתנול.
3. הכנס את העמוד בחזרה לצינור האיסוף, העביר את התערובת לעמוד, צנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (13,800 ×g) למשך 30 - 60 שניות.אם נפח התמיסה המעורבת הוא > 700 μL, הכנס את עמודת הספיחה בחזרה לצינור האיסוף, העביר את התמיסה שנותרה לעמוד הספיחה, וצנטריפוגה ב-12,000 סל"ד (13,800 × גרם) למשך 30 - 60 שניות.
4. הביצוע הבא מתייחס לשלב 5 - 8 של תוכנית 08- 1/מיצוי ג'ל.
יישומים
ריכוזים שונים של TAE או TBE agarose gel;מוצרי PCR, מערכות תגובה אנזימטיות או מוצרי DNA גולמיים אחרים המתקבלים בשיטות שונות.שברים ששוחזרו נע בין70 bp -20 kb.
הערות
לשימוש מחקר בלבד.לא לשימוש בהליכי אבחון.
1. הוסף 80 מ"ל של אתנול כדי לדלל Buffer GW כפי שמצוין בתג לפני השימוש, אחסן בטמפרטורת החדר.
2. אם קל לזרז את ה-Buffer GDP במהלך אחסון בטמפרטורה נמוכה, ניתן למקם אותו בטמפרטורת החדר למשך פרק זמן לפני השימוש.במידת הצורך, ניתן לחמם אותו מראש באמבט מים של 37℃ עד להמסה מלאה של המשקע, ולאחר מכן ניתן להשתמש בו לאחר ערבוב.
3. הגדר מראש את טמפרטורת אמבט המים ל-50 ~55℃.
4. בשלב 1 של תוכנית מיצוי ג'ל 08-1/ג'ל, מזעור גודל פרוסת הג'ל תקטין משמעותית את זמן ההמסה ותגביר את יעילות ההתאוששות (DNA ליניאריז קל להידרוליזה כאשר הוא נחשף ללא הרף בטמפרטורה גבוהה).אל תחשוף את ג'ל ה-DNA ל-UV למשך זמן רב, מכיוון שאור אולטרה סגול עלול לגרום לנזק ל-DNA.
5. ממיסים את הג'ל בשלב 2 של תוכנית מיצוי 08- 1/Gel לחלוטין, אחרת יעילות שחזור ה-DNA תושפע קשות.
6. מחממים מראש מאגר elution או ddH2O ל-55℃, מה שמועיל לשיפור יעילות דליפת ה-DNA.מומלץ לאחסן DNA בפלטה של 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
