ערכת EndoFree Plasmid Maxi
ערכה זו מתאימה למיצוי מ-150 - 300 מ"ל של תמיסה חיידקית בתרבית למשך הלילה, תוך שימוש בשיטת תמוגה בסיסית SDS משופרת לליזה של החיידקים.התמצית הגולמית משולבת באופן סלקטיבי עם אנדוטוקסין ייחודי ומופרדת באמצעות צנטריפוגה להסרת אנדוטוקסינים.לאחר מכן, קרום סיליקה ג'ל נקשר באופן סלקטיבי ל-DNA פלסמיד בתמיסה בתנאים של מלח גבוה ו-pH נמוך.לאחר מכן הוספת חיץ כביסה להסרת זיהומים ורכיבים חיידקיים אחרים.לבסוף, נעשה שימוש במאגר elution נמוך מלח ו-pH גבוה כדי להוציא DNA פלסמיד טהור מממברנת מטריצת הסיליקון.קרום סיליקה ג'ל משתמש בממברנת ספיחה מיוחדת, והפרש כמות הספיגה בין העמודה לעמוד קטן מאוד והחזרה טובה.פנול, כלורופורם וריאגנטים רעילים אחרים אינם נדרשים, וגם לא שלבי משקעים אתנול.ניתן להשתמש בערכה זו כדי לחלץ במהירות 0.2 -1.5 מ"ג של DNA פלסמיד טהור בעל עותק גבוה, עם קצב מיצוי של 80% -90%.הערכה משתמשת בנוסחת תהליך ייחודי מסירה אנדוטוקסין, תכולת האנדוטוקסין נמוכה ביותר ואפקט העברת התאים מצוין.ניתן להשתמש בפלסמיד המופק ישירות בעיכול אנזים, PCR, שעתוק במבחנה, טרנספורמציה, רצף וניסויים אחרים בביולוגיה מולקולרית.
תנאי אחסון
יש לאחסן RNaseA ב -30 ~ -15 ℃ ולהעביר אותו ב ≤0 ℃.
ניתן לאחסן את אנדוטוקסין בטמפרטורה של 2 ~ 8℃ למשך חודש אחד, לאחסן ב -30 ~ -15℃ לאחסון לטווח ארוךומועבר ב-≤0℃.
יש לאחסן רכיבים אחרים בטמפרטורת החדר (15 ~ 25℃) ולהעביר אותם בטמפרטורת החדר.
רכיבים
| רכיבים | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| מאגר P1 | 75 מ"ל |
| מאגר P2 | 75 מ"ל |
| מאגר P4 | 75 מ"ל |
| מנקה אנדוטוקסין | 25 מ"ל |
| Buffer PW | 2 × 22 מ"ל |
| שחפת מאגר | 20 מ"ל |
| FastPure DNA Maxi Columns (כל אחד בשפופרת איסוף של 50 מ"ל) | 10 |
| שפופרת איסוף ללא אנדוטוקסינים | 2 × 5 |
RNaseA:10 מ"ג/מ"ל, משמש להסרת RNA.
מאגר P1:חיץ השעיה חיידקי, הוסף RNaseA למאגר P1 לפני השימוש הראשון.
מאגר P2:חיץ תמוגה חיידקי (המכיל SDS/NaOH).
מאגר P4:חיץ מנטרל.
מנקה אנדוטוקסין:הסר ביעילות אנדוטוקסין מתמצית הפלסמיד הגולמית.
מאגר PW:חיץ כביסה, הוסף את נפח האתנול שנקבע לפני השימוש הראשון.
שחפת מאגר:חיץ פליטה.
FastPure DNA Maxi Columns:עמודות ספיחת DNA של פלסמיד.
צינורות איסוף 50 מ"ל:צינורות איסוף סינון.
צינור איסוף ללא אנדוטוקסינים:צינורות איסוף DNA של פלסמיד.
חומרים מוכנים
אתנול מוחלט, איזופרופנול, 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם תחתית עגולה ו-50 מ"ל ללא אנדוטוקסיניםצינורות צנטריפוגה.
יישומים
מוצר זה מתאים למיצוי בקנה מידה גדול של פלסמידים מ-150 - 300 מ"ל של תמיסה חיידקיתמתורבת בן לילה.
תהליך ניסוי
1. קח 150 - 200 מ"ל (לא יותר מ-300 מ"ל) תמיסת חיידקים בתרבית למשך הלילה וצנטריפוגה בשעהכ-11,000 סל"ד (12,000 × גרם) למשך 1-2 דקות.השליכו את הסופרנטנט ואספו חיידקים.
Δ כאשר אוספים יותר מ-50 מ"ל תמיסת חיידקים, ניתן לאסוף את החיידקים על ידי הוספת תמיסה חיידקית, צנטריפוגה, השלכת הסופרנטנט ושלבים נוספים באותה צינורית של 50 מ"ל עבור
מספר פעמים.
2. הוסף לצנטריפוגה 7.5 מ"ל של Buffer P1 (נא לבדוק אם RNaseA התווסף למאגר P1)צינור המכיל חיידקים ומערבבים היטב על ידי מערבולת או פיפטציה.
Δ ההשעיה המחודשת של חיידקים בשלב זה היא קריטית כדי להניב, ולא אמורים להיות גושים של חיידקים לאחר ההשעיה מחדש.אם יש גושים של חיידקים שאינם מעורבבים היטב, זה ישפיע על התמוגג, וכתוצאה מכך יבול וטוהר נמוכים.אם ה-OD600 של תמיסה חיידקית הוא 0.65, מומלץ להשתמש ב-7.5 מ"ל של Buffer P1 בעת מיצוי מ-150 מ"ל של תמיסה חיידקית;כאשר OD600 הוא 0.75, יש להשתמש ב-8 מ"ל של Buffer P1 ולשנות את הנפחים של Buffers P2 ו-P4 בהתאם.אם נפח התמיסה החיידקית גדל ל-200 מ"ל, מומלץ שה-נפח החצצים P1, P2 ו-P4 יוגדל באופן פרופורציונלי.
3. הוסף 7.5 מ"ל של Buffer P2 לתרחיף החיידקים משלב 2 וערבב בעדינות למעלה ולמטה במשך 6 - 8פעמים ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 דקות.
Δ הפוך בעדינות כדי לערבב ביסודיות.מערבולת תגרום לפיצול ה-DNA הגנומי, וכתוצאה מכך יהיו שברי DNA גנומי בפלסמיד המופק.בשלב זה, התמיסה הופכת לצמיגה ושקופה, מה שמראה שהחיידקים עברו ליזום מלא.משך הזמן לא יעלה על 5 דקות כדי למנוע הרס של הפלסמידים.אם התמיסה אינה ברורה, ייתכן שהתוצאה היא יותר מדי חיידקיםתמוגה לא מלאה, ולכן יש להפחית את כמות החיידקים כראוי.
4. הוסף 7.5 מ"ל של Buffer P4 לתרחיף החיידקים משלב 3 והפוך מיד בעדינות 6 - 8 פעמים כדי לאפשר לתמיסה לנטרל לחלוטין את Buffer P2.בשלב זה, אמור להופיע משקעים צבועים לבנים.צנטריפוגה במהירות של יותר מכ-11,000 סל"ד (12,000 × גרם) במשך 10 - 15 דקות, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לתוך שפופרת צנטריפוגה עגולה תחתית חדשה בנפח 50 מ"ל (הוכנה עצמית), והימנעולשאוב את המשקע הלבן הצף.
Δ הוסף מאגר P4 והפוך מיד לערבב היטב.השאירו את הצינור לעמוד עד שהמשקע הלבן יתפזר באופן שווה בכל התמיסה כדי למנוע ייצור של משקעים מקומיים שעלולים להשפיע על הנטרול.אם אין משקעים פלקטיים לבנים אחידים לפני הצנטריפוגה והסופרנטנט אינו ברור לאחר הצנטריפוגה, ניתן לבצע את הצינוריתצנטריפוגה למשך 5 דקות נוספות.
5. הוסף פי 0.1 מהנפח (10% מנפח הסופרנטנט, כ-2.2 מ"ל) של Endotoxin Scavenger לסופרנטנט משלב 4 והפוך לערבב.מניחים את התמיסה באמבט קרח או מכניסים לקרח כתוש (או למקפיא במקרר) למשך 5 דקות עד שהתמיסה משתנה מעכורה לשקופה ושקופה (או עדייןמעט עכור), ומדי פעם מערבבים מספר פעמים.
Δ לאחר הוספת חומר האנדוטוקסין לסופרנטנט, הסופרנטנט יהפוך לעכור אךהסופרנטנט צריך להיות שקוף (או מעט עכור) לאחר קירור באמבט הקרח.
6. לאחר שהסופרנטנט הונח בטמפרטורת החדר (>25℃) למשך 10 - 15 דקות, הוא יהפוך לעכורהטמפרטורה שלו עולה לטמפרטורת החדר.לאחר מכן יש להפוך את הסופרנטנט כדי לערבב.
Δ אם טמפרטורת החדר נמוכה יותר או אם ברצונך להפחית את זמן המיצוי, ניתן להדגיר את הסופרנטנט באמבט מים של 37 ~ 42 ℃ למשך 5 - 10 דקות וניתן לבצע את השלב הבא לאחר הסופרנטנט.הופך לעכור.
7. צנטריפו את הסופרנטנט בכ-11,000 סל"ד (12,000 × גרם) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (הטמפרטורה חייבת להיות מעל 25 מעלות צלזיוס) כדי להפריד את הפאזה.הפאזה המימית העליונה מכילה את ה-DNA ואילו שכבת הפאזה השמנונית התחתונה מכילה אנדוטוקסין וזיהומים אחרים.העבר אתשלב מימי המכיל DNA לצינור חדש ולזרוק את השכבה השמנונית.
Δ הטמפרטורה במהלך הצנטריפוגה חייבת להיות מעל 25℃ מכיוון שהפרדת פאזות יעילה אינה עושה זאתלהתרחש אם הטמפרטורה נמוכה מדי.
Δ אם הפרדת הפאזות אינה יעילה, ניתן להתאים את טמפרטורת הצנטריפוגה ל-30℃ וניתן להגדיל את זמן הצנטריפוגה ל-15 דקות.
Δ אל תמצוץ את השכבה השמנונית הכחולה מכיוון שהיא מכילה אנדוטוקסין וזיהומים אחרים.
מַנגָנוֹן
נטרול ליזה מחדש
◇ הוסף 7.5 מ"ל מאגר P1
◇ הוסף 7.5 מ"ל Buffer P2
◇ הוסף 7.5 מ"ל Buffer P4
הסרת אנדוטוקסינים
◇ הוסף פי 0. 1 מנפח הסופרנטנט של אנדוטוקסין סורק
כריכה וכביסה
◇ הוסף פי 0.5 מנפח האיזופרופנול
◇ הוסף 10 מ"ל Buffer PW
◇ הוסף 10 מ"ל Buffer PW
שחרור
◇ הוסף 1 – 2 מ"ל Buffer TB או ddH2O ללא אנדוטוקסין
