Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG או UDG) הוא שיבוט רקומביננטי של E.coli עם משקל מולקולרי של 25 kDa.הוא מזרז שחרור של אורציל חופשי מ-DNA חד-גדילי ודו-גדילי המכיל אורציל, ואינו פעיל נגד RNA, וניתן להשתמש בו כדי למנוע זיהום של מוצרי הגברה של PCR.עקרון הפעולה מבוסס על העובדה שאם dUTP מוחלף ב-dTTP בתגובת PCR ונוצר תוצר הגברה של PCR המכיל בסיסי dU, האנזים יכול לשבור באופן סלקטיבי את הקשר הגליקוזידי של בסיסי U ביחיד גדילי ודו גדילי. DNA ופירוק תוצר הגברה של PCR.
יישום מומלץ
הגברה למניעת זיהום
מצב אחסון
-20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך, יש לערבב היטב לפני השימוש, להימנע מהקפאה-הפשרה תכופה.
מאגר אחסון
20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ DTT, מייצב, 50% גליצרול.
הגדרת יחידה
כמות האנזים הדרושה לפירוק של 1 מיקרוגרם של DNA חד-גדילי המכיל בסיסי dU בשעה אחת ב-37°C היא יחידה אחת.
בקרת איכות
1.טוהר אלקטרופורטי SDS-PAGE גדול מ-98%
2.רגישות הגברה, בקרת אצווה לאצווה, יציבות
3.לאחר טיפול ב-1U של UNG בטמפרטורה של 50℃ למשך 2 דקות, התבנית המכילה U מתחת ל-103 עותקים אמורה להתפרק לחלוטין ולא ניתן לייצר מוצר הגברה
4.אין פעילות נוקליאז אקסוגנית
הוראות
| רכיבים | נפח (μL) | ריכוז סופי |
| 10 × מאגר PCR (ללא dNTP, Mg²+חינם) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 מיקרומטר |
| dUTP (החלף dTTP) | - | 200-600 מיקרומטר |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 מ"מ |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × פריימר מיקסא | 2 | 1× |
| תבנית | - | ＜1 מיקרוגרם/תגובה |
| ddH₂O | עד 50 | - |
הערה: ת: אם משתמשים ב-qPCR/qRT-PCR, יש להוסיף את הבדיקה הפלורסנטית למערכת התגובה.בדרך כלל, ריכוז פריימר סופי של 0.2 מיקרומטר יכול לתת תוצאות טובות;כאשר ביצועי התגובה גרועים, ניתן להתאים את ריכוז הפריימר בטווח של 0.2-1 מיקרומטר.בדרך כלל, ריכוז הבדיקה עובר אופטימיזציה בטווח של 0.1-0.3 מיקרומטר.ניתן לבצע ניסויי שיפוע ריכוז כדי למצוא את השילוב הטוב ביותר של פריימר ובדיקה.
הערות
1.ניתן להשתמש באנזים UNG כדי להסיר את מוצרי ההגברה המזוהמים של dUTP ממערכת התגובה לפני תגובת הגברה של PCR, ולאחר מכן כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות עקב זיהום המוצר.
2.הטמפרטורה האופטימלית עבור שימוש באנזים UNG בתגובת PCR נגד זיהום היא בדרך כלל 50 ℃ למשך 2 דקות;מצב אי ההפעלה הוא 95℃ למשך 5 דקות.
3.הימנע מהקפאה-הפשרה תכופה, ואל תחשוף לתנודות טמפרטורה גדולות.
4.לגנים שונים שיש להגביר יש יעילות ניצול שונה של dUTP ורגישות לאנזים UNG, לכן, אם השימוש במערכת UNG מוביל לירידה ברגישות הזיהוי, יש להתאים את מערכת התגובה ולבצע אופטימיזציה, אם אתה זקוק לתמיכה טכנית, אנא צור קשר החברה שלנו.
