Proteinase K NGS (אבקה)
מספר חתול: HC4507A
NGS Protease K הוא פרוטאז סרין יציב עם פעילות אנזים גבוהה וסגוליות סובסטרט רחבה. האנזים מפרק באופן מועדף קשרי אסטר וקשרי פפטיד בצמוד למסוף C של חומצות אמינו הידרופוביות, חומצות אמינו המכילות גופרית וחומצות אמינו ארומטיות.לכן, הוא משמש לעתים קרובות לפירוק חלבונים לפפטידים קצרים.NGS Protease K הוא פרוטאז סרין טיפוסי עם Asp39-שֶׁלוֹ69-סר224טריאדה קטליטית שהיא ייחודית לפרוטאזות סרין, והמרכז הקטליטי מוקף בגרור Ca2+אתרי קישור לייצוב, שמירה על פעילות אנזים גבוהה במגוון רחב יותר של תנאים.
מִפרָט
| מראה חיצוני | אבקה אמורפית לבנה עד אוף-ווייט, ליופיליזית |
| פעילות ספציפית | ≥40U/mg מוצק |
| DNase | אף אחד לא זוהה |
| RNase | אף אחד לא זוהה |
| עומס ביולוגי | ≤50CFU/g מוצק |
| שאריות חומצת גרעין | <5pg/mg מוצק |
נכסים
| מָקוֹר | אלבום Tritirachium |
| מספר EC | 3.4.21.64(רקומביננטי מאלבום Tritirachium) |
| משקל מולקולרי | 29kDa (SDS-PAGE) |
| נקודה איזואלקטרית | 7.81 איור 1 |
| pH אופטימלי | 7.0-12.0 (כולם מבצעים פעילות גבוהה) איור 2 |
| טמפרטורה אופטימלית | 65℃ איור 3 |
| יציבות pH | pH 4.5-12.5 (25℃,16 שעות) איור 4 |
| יציבות תרמית | מתחת ל-50℃ (pH 8.0, 30 דקות) איור 5 |
| יציבות אחסון | מאוחסן ב-25℃ למשך 12 חודשים איור 6 |
| מפעילים | SDS, אוריאה |
| מעכבים | דיאיזופרופיל פלואורפוספט;בנזילסולפוניל פלואוריד |
תנאי אחסון
אחסן את האבקה הליופילית ב-25 ~ -15 ℃ במשך זמן רב הרחק מאור;לאחר הפירוק, מנה לתוך נפח מתאים לאחסון לטווח קצר ב-2-8℃ הרחק מאור או אחסון לטווח ארוך ב-25~-15 ℃ הרחק מאור.
אמצעי זהירות
ללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן בעת שימוש או שקילה, ולשמור היטב על אוורור לאחר השימוש.מוצר זה עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור ולגירוי חמור בעיניים.בשאיפה זה עלול לגרום לתסמיני אלרגיה או אסטמה או קוצר נשימה.עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה.
הגדרת יחידה
יחידה אחת של NGS Protease K מוגדרת ככמות האנזים הדרושה להידרוליזה של קזאין ל-1 מיקרומול L-tyrosine בתנאי קביעה סטנדרטיים.
הכנת ריאגנטים
| מֵגִיב | יַצרָן | קָטָלוֹג |
| קזאין טכנימחלב בקר | סיגמא אולדריך | C7078 |
| NaOH | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 20040718 |
| Na2HPO4 | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 20040618 |
| חומצה טריכלורואצטית | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 80132618 |
| נתרן אצטט | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 10018818 |
| חומצה אצטית | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 10000218 |
| HCl | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 10011018 |
| נתרן קרבונט | סינופרם כימיקלריאג'נט ושות' בע"מ | 10019260 |
| פולין-פנול | Sangon Biotech (שנחאי)בע"מ. | A500467-0100 |
| ל-טירוזין | סיגמא | 93829 |
מגיב I:
מצע: 1% קזאין מתמיסת חלב בקר: ממיסים 1 גרם קזאין מחלב בקר ב-50 מ"ל של תמיסת 0.1M נתרן פוספט, pH 8.0, מחממים באמבט מים ב-65-70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, מערבבים וממיסים, מצננים במים, מותאם לפי נתרן הידרוקסיד ל-pH 8.0, ולדלל ל-100 מ"ל.
ריאגנט II:
תמיסת TCA: 0.1M חומצה טריכלורואצטית, 0.2M נתרן אצטט ו-0.3M חומצה אצטית (שקול 1.64 גרם חומצה טריכלורואצטית + 1.64 גרם נתרן אצטט + 1.724 מ"ל חומצה אצטית ברצף, הוסף 50 מ"ל דה-יון ומים, כוונן עם HCl 4 ל-PH03. 100 מ"ל).
ריאגנט III:
תמיסה של 0.4 מ' נתרן קרבונט (לשקול 4.24 גרם נתרן קרבונט נטול מים ולהמיס ב-100 מ"ל מים)
מגיב IV:
מגיב פנול פולין: דלל 5 פעמים במים מפושטים.
מגיב V:
מדלל אנזים: תמיסת נתרן פוספט 0.1M, pH 8.0.
מגיב VI:
תמיסה סטנדרטית L-tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tyrosine מומס עם 0.2M HCl.
תהליך
1. הפעל את ספקטרופוטומטר UV-Vis ובחר במדידה פוטומטרית.
2. הגדר את אורך הגל כ-660nm.
3. הפעל את אמבט המים, הגדר את הטמפרטורה ל-37℃, ודא שהטמפרטורה לא השתנתה למשך 3-5 דקות.
4. מחממים מצע של 0.5 מ"ל בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל באמבט מים של 37 מעלות למשך 10 דקות.
5. חלץ 0.5 מ"ל תמיסת אנזים מדוללת לתוך צינור הצנטריפוגה המחומם מראש למשך 10 דקות.הגדר את מדלל האנזים כקבוצה ריקה.
6. הוסף 1.0 מ"ל מגיב TCA מיד לאחר התגובה.מערבבים היטב ומדגרים באמבט מים למשך 30 דקות.
7. תמיסת תגובה צנטריפוגה.
8. הוסף את הרכיבים הבאים בסדר שצוין.
| מֵגִיב | כרך |
| סופרנטנט | 0.5 מ"ל |
| 0.4M נתרן קרבונט | 2.5 מ"ל |
| מגיב פולין פנול | 0.5 מ"ל |
9. ערבבו היטב לפני הדגירה באמבט מים בטמפרטורה של 37℃ למשך 30 דקות.
10. OD660נקבע כ-OD1;קבוצת ביקורת ריקה: מדלל אנזים משמש להחלפת תמיסת אנזים לקביעת OD660בתור OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. עקומת תקן L-tyrosine: 0.5 מ"ל תמיסת L-tyrosine בריכוז שונה, 2.5 מ"ל 0.4M נתרן קרבונט, 0.5 מ"ל מגיב פולין פנול בשפופרת צנטריפוגה 5 מ"ל, דגירה ב-37 מעלות למשך 30 דקות, זיהוי OD660עבור ריכוז שונה של L-tyrosine, לאחר מכן התקבלה עקומה הסטנדרטית Y=kX+b, כאשר Y הוא ריכוז L-tyrosine, X הוא OD600.
תַחשִׁיב
2: נפח כולל של תמיסת תגובה (מ"ל)
0.5: נפח תמיסת אנזים (מ"ל)
0.5: נפח נוזל תגובה בשימוש בקביעה כרומוגנית (מ"ל)
10: זמן תגובה (דקות)
Df: דילול מרובה
C: ריכוז אנזים (מ"ג/מ"ל)
דמויות
איור 1 שאריות DNA
| לִטעוֹם | Ave C4 | חומצות גרעין שחזור (pg/mg) | התאוששות(%) | סך הכל גרעיני חומצה ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O ללא RNA | לא נקבע | — | — | — |
איור.2 pH אופטימלי
איור 3 טמפרטורה אופטימלית
איור 4 יציבות pH
איור 5 יציבות תרמית
איור 6 יציבות אחסון ב-25℃
