M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase הוא תמלול הפוך המתקבל על ידי בדיקת מוטציות של הגן M-MLV של מקור וביטוי נגיף הלוקמיה של Moloney ב-E.coli.האנזים מסיר את פעילות RNase H, בעל סבילות לטמפרטורה גבוהה יותר ומתאים לשעתוק הפוך בטמפרטורה גבוהה.לכן, זה מועיל לביטול ההשפעות השליליות של מבנה RNA ברמה גבוהה וגורמים לא ספציפיים על סינתזת cDNA, ויש לו יציבות גבוהה יותר ויכולת סינתזת שעתוק הפוכה.לאנזים יציבות גבוהה יותר ויכולת סינתזת שעתוק לאחור.
רכיבים
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × מאגר קצה ראשון (אופציונלי)
* 5 × מאגר רצף ראשון אינו מכיל dNTP, אנא הוסף dNTPs בעת הכנת מערכת התגובה
יישום מומלץ
1.qRT-PCR חד-שלבי.
2.זיהוי וירוס RNA.
מצב אחסון
-20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך, יש לערבב היטב לפני השימוש, להימנע מהקפאה-הפשרה תכופה.
הגדרת יחידה
יחידה אחת משלבת 1 ננומול של dTTP ב-10 דקות ב-37°C באמצעות poly(A)•oligo(dT)25כתבנית/פריימר.
בקרת איכות
1.טוהר אלקטרופורטי SDS-PAGE גדול מ-98%.
2.רגישות הגברה, בקרת אצווה לאצווה, יציבות.
3.ללא פעילות נוקלאז אקסוגנית, ללא אנדונוקלאז או זיהום אקסוגני
הגדרת תגובה לפתרון תגובת שרשרת ראשונה
1.הכנת תערובת התגובה
| רכיבים | כרך |
| אוליגו(dT)12-18 תֶחֶל או פריימר אקראיא או פריימרים ספציפיים לגניםb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 מ"מ dNTP | 1 μL |
| תבנית RNA | סך RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 מיקרוגרם |
| dH ללא RNase2O | עד 10 μL |
הערות:a/b: אנא בחר סוגים שונים של פריימרים בהתאם לצרכים הניסויים שלך.
2.מחממים ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומצננים במהירות על קרח למשך 2 דקות.
3.הוסף את הרכיבים הבאים למערכת שלעיל לנפח כולל של 20µL וערבב בעדינות:
| רכיבים | כרך (μL) |
| 5 × מאגר רצף ראשון | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| מעכב RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH ללא RNase2O | עד 20 μL |
4. אנא בצע את התגובה לפי התנאים הבאים:
(1) אם נעשה שימוש פריימר אקראי, התגובה צריכה להתבצע ב-25 מעלות למשך 10 דקות, ולאחר מכן ב-50 מעלות למשך 30-60 דקות;
(2) אם נעשה שימוש ב-Oligo dT או בפריימרים ספציפיים, התגובה צריכה להתבצע ב-50 ℃ למשך 30 ~ 60 דקות.
5.מחממים ב-95℃ למשך 5 דקות כדי להשבית את Neoscript Reverse Transcriptase ולהפסיק את התגובה.
6.ניתן להשתמש במוצרי שעתוק הפוך ישירות בתגובת PCR ותגובת PCR כמותית פלואורסצנטית, או לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך זמן רב.
PCR Rפעולה:
1.הכנת תערובת התגובה
| רכיבים | ריכוז |
| 10 × מאגר PCR (ללא dNTP, ללא Mg²+) | 1× |
| dNTPs (10mM כל dNTP) | 200 מיקרומטר |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 מ"מ |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| פריימר 1 (10 מיקרומטר) | 0.2-1 מיקרומטר |
| פריימר 2 (10 מיקרומטר) | 0.2-1 מיקרומטר |
| תבניתא | ≤10% תמיסת תגובת שרשרת ראשונה (2 μL) |
| ddH2O | עד 50 μL |
הערות:ת: אם מוסיפים יותר מדי תמיסת תגובת שרשרת ראשונה, תגובת ה-PCR עלולה להיות מעוכבת.
2.הליך תגובת PCR
| שלב | טֶמפֶּרָטוּרָה | זְמַן | מחזורים |
| טרום דנטורציה | 95℃ | 2-5 דקות | 1 |
| דנטורציה | 95℃ | 10-20 שניות | 30-40 |
| רִכּוּך | 50-60℃ | 10-30 שניות | |
| סיומת | 72℃ | 10-60 שניות |
הערות
1.מתאים לאופטימיזציה של טמפרטורת שעתוק הפוך בטווח של 42℃ ~ 55℃.
2.יש לו יציבות טובה יותר, מתאים להגברת שעתוק לאחור בטמפרטורה גבוהה.בנוסף, הוא מתאים למעבר יעיל דרך אזורים מבניים מורכבים של RNA.כמו כן, זהמתאים לזיהוי RT-PCR כמותי מרובי פלואורסצנטי שלב אחד.
3.תאימות טובה לאנזימי הגברה שונים של PCR ומתאימה לתגובות RT-PCR ברגישות גבוהה.
4.מתאים לתגובת RT-PCR כמותית עם רגישות גבוהה שלב אחד פלואורסצנטי, משפר ביעילות את קצב הזיהוי של ריכוז נמוך של תבניות.
5.מתאים לבניית ספריית cDNA.
