M-MLV Transcriptase לאחור
RevScript Reverse transcriptase מתקבל על ידי טכנולוגיית הנדסה גנטית.יש לו יכולת סינתזת cDNA גבוהה יותר, יציבות תרמית ומגבלת טמפרטורת תגובה (עד 60 מעלות צלזיוס).מוצר ה-cDNA המסונתז הוא עד 10 קילובייט.זה משפר את הזיקה של התבניות ומתאים לשעתוק הפוך של תבניות RNA עם מבנה משני מורכב או גנים בעלי העתקה נמוכה.
רכיבים
| רְכִיב | HC2003B-01 (10,000U) | HC2003B-02 (5*10,000U) | HC2003B-03 (200,000U) |
| RevScript Transcriptase הפוך (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 מ"ל |
| 5 × מאגר RevScript | 250 μL | 1.25 מ"ל | 5 מ"ל |
מצב אחסון
יש לאחסן מוצר זה ב-25°C~-15°C למשך שנתיים.
הגדרת יחידה
יחידה אחת משלבת 1 ננומול של dTTP בחומר בלתי מסיס בחומצה תוך 10 דקות ב-37°C באמצעות Oligo(dT) כפריימרים.
הגדרת תגובה
1. דנטורציה של תבנית RNA (שלב זה הוא אופציונלי, דנטורציה של תבנית RNA עוזרת לפתוח את המבנים המשניים, מה שישפר את התפוקה של cDNA הגדיל הראשון.)
| רכיבים | כרך (μL) |
| DDH ללא RNase2O | עד 13 |
| אוליגו(dT)18 (50 מיקרומול/ליטר) או פריימר אקראי (50 מיקרומול/ליטר) או פריימרים ספציפיים לגנים (2 מיקרומול/ליטר) | 1 |
| או 1 | |
| או 1 | |
| תבנית RNA | איקסa |
הערות:
1) a: RNA כולל: 1-5 ug או mRNA: 1-500 ng
2) דגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן העברה על קרח מיד לצינון למשך 2 דקות.צנטריפוגה קצרה לאיסוף נוזל תגובה, הוסף את תמיסת תגובת השעתוק ההפוכה כפי שמוצג בטבלה הבאה.פיפטט בעדינות כדי לערבב.
1. הכנת תערובת התגובה (נפח 20 μL)
| רכיבים | כרך (μL) |
| תערובת של שלב קודם | 13 |
| 5× מאגר | 4 |
| מיקס dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Transcriptase הפוך (200 U/μL) | 1 |
| מעכב RNase (40 U/μL) | 1 |
1.בצע את התגובה בתנאים הבאים:
| טמפרטורה (°C) | זְמַן |
| 25 מעלות צלזיוסa | 5 דקות |
| 42 מעלות צלזיוסb | 15-30 דקות |
| 85 מעלות צלזיוסc | 5 דקות |
הערות:
1) א.דגירה ב-25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נדרשת רק לשימוש בהקסמרים אקראיים.אנא דלג על שלב זה בעת שימוש ב-Oligo (dT)18או פריימר ספציפי לגנים.
2) ב.טמפרטורת השעתוק ההפוכה המומלצת היא 42°C, עבור תבניות עם מבנים משניים מסובכים או תכולת GC גבוהה, מומלץ להעלות את טמפרטורת התגובה ל-50-55°C.
3) ג.חימום ב-85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לבטל את ההפעלה של תמלול הפוך.
4) ניתן להשתמש במוצר ישירות בתגובות PCR או qPCR, או לאחסן ב-20°C לאחסון לטווח קצר.מומלץ ליישר את המוצרים ולאחסן ב-80°C לאחסון לטווח ארוך.הימנע מהקפאה-הפשרה תכופה.
5) המוצר מתאים ל-RT-qPCR חד-שלבי, מומלץ להוסיף 10-20 U transcriptase לאחור לכל מערכת תגובה של 25μL, או להגדיל בהדרגה את כמות ה-reverse transcriptase בהתאם למצב בפועל.
הערות
1.נא לשמור על אזור הניסוי נקי;יש ללבוש כפפות ומסכות נקיות במהלך הפעולה.כל החומרים המתכלים המשמשים בניסוי צריכים להיות ללא RNase כדי למנוע זיהום RNase.
2. כל ההליכים צריכים להתבצע על קרח כדי למנוע פירוק RNA.
3. דגימות RNA באיכות גבוהה מומלצות כדי להבטיח יעילות גבוהה של שעתוק הפוך.
4. מוצר זה מיועד לשימוש מחקר בלבד.
5. נא לפעול עם מעילי מעבדה וכפפות חד פעמיות, למען בטיחותך.
