ערכת CHO HCP ELISA
בבדיקה זו נעשה שימוש בשיטת אימונוסורבנט חד-שלבי ELISA.דגימות המכילות CHOK1 HCP מגיבות בו-זמנית עם נוגדן עז לעז מסומן HRP ונוגדן אנטי-CHOK1 המצופים על צלחת ELISA, ולבסוף יוצרות קומפלקס סנדוויץ' של נוגדן שלב מוצק עם נוגדן מסומן HCP.ניתן להסיר אנטיגן-נוגדן לא קשור על ידי שטיפת צלחת ELISA.מצע TMB מתווסף לבאר לתגובה מספקת.התפתחות הצבע נעצרת לאחר הוספת תמיסת העצירה, וערך ה-OD או הספיגה של תמיסת התגובה ב-450/650 ננומטר נקרא עם קורא מיקרו-לוחות.ערך ה-OD או ערך הספיגה פרופורציונלי לתכולת ה-HCP בתמיסה.מכאן ניתן לחשב את ריכוז ה-HCP בתמיסה לפי עקומת התקן.
יישום
ערכה זו משמשת לזיהוי כמותי של התוכן של שאריות חלבון תא מארח CHOK1 בדגימות.
Cמתנגדים
| S/N | רְכִיב | ריכוז | תנאי אחסון |
| 1 | CHOK1 HCP תקן | 0.5 מ"ג/מ"ל | ≤–20℃ |
| 2 | Anti-CHO HCP-HRP | 0.5 מ"ג/מ"ל | ≤–20℃, הגן מפני אור |
| 3 | TMB | NA | 2-8℃, להגן מפני אור |
| 4 | 20 × PBST 0.05% | NA | 2-8℃ |
| 5 | עצור פתרון | NA | RT |
| 6 | אוטמי מיקרופלייט | NA | RT |
| 7 | BSA | NA | 2-8℃ |
| 8 | לוחות ציפוי מראש בספיחה גבוהה | NA | 2-8℃ |
ציוד נדרש
| חומרים מתכלים / ציוד | יִצוּר | קָטָלוֹג |
| קורא Microplate | מכשירים מולקולריים | Spectra Max M5, M5e או שווה ערך |
| תרמומיקסר | אפנדורף | Eppendorf/5355, או שווה ערך |
| מערבל וורטקס | IKA | MS3 Digital, או שווה ערך |
אחסון ויציבות
1.הובלה ב-25~-15°C.
2.תנאי האחסון הם כפי שמוצג בטבלה 1;רכיבים 1-2 מאוחסנים ≤-20°C, 5-6 מאוחסנים RT,3、4、7、8 מאוחסנים ב-2-8℃;תקופת התוקף היא 12 חודשים.
פרמטרים של מוצר
1.רגישות: 1ng/mL
2.טווח זיהוי: 3-100ng/mL
3.דיוק: CV תוך-מבחן < 10%, CV בין-מבחן < 15%
4.כיסוי HCP: >80%
5.ספציפיות: ערכה זו היא אוניברסלית מכיוון שהיא מגיבה ספציפית עם CHOK1 HCP ללא תלות בתהליך הטיהור.
הכנת ריאגנטים
1.PBST 0.05%
קח 15 מ"ל של 20×PBST 0.05%, מדולל ב-ddH2הו, ומכיל עד 300 מ"ל.
2.1.0% BSA
קח 1 גרם BSA מהבקבוק ודלל ב-100 מ"ל של PBST 0.05%, ערבב היטב עד להמסה מלאה ואחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.חיץ הדילול המוכן תקף למשך 7 ימים.מומלץ להכין לפי הצורך.
3.תמיסת איתור 2μg/mL
קח 48μL של 0.5 מ"ג/מ"ל Anti-CHO HCP-HRP ודלל ב-11,952μL של 1% BSA כדי לקבל ריכוז סופי של תמיסת זיהוי של 2μg/mL.
4.QC והכנת תקני CHOK1 HCP
| צינור לא. | מְקוֹרִי | ריכוז | כרך | 1%BSA | נפח כולל | סופי |
| A | תֶקֶן | 0.5 מ"ג/מ"ל | 10 | 490 | 500 | 10,000 |
| B | A | 10,000 | 50 | 450 | 500 | 1,000 |
| S1 | B | 1,000 | 50 | 450 | 500 | 100 |
| S2 | S1 | 100 | 300 | 100 | 400 | 75 |
| S3 | S2 | 75 | 200 | 175 | 375 | 40 |
| S4 | S3 | 40 | 150 | 350 | 500 | 12 |
| S5 | S4 | 12 | 200 | 200 | 400 | 6 |
| S6 | S5 | 6 | 200 | 200 | 400 | 3 |
| NC | NA | NA | NA | 200 | 200 | 0 |
| QC | S1 | 100 | 50 | 200 | 250 | 20 |
טבלה: הכנת QC ותקנים
נוהל בדיקה
1.הכן את הריאגנטים כפי שמצוין ב"הכנת ריאגנטים" לעיל.
2.קח 50μL של תקנים, דגימות ו-QCs (עיין בטבלה 3) לכל באר, ולאחר מכן הוסף 100μL של תמיסת איתור (2μg/mL);מכסים את הצלחת בסילר ומניחים את צלחת ELISA על התרמומיקסר.דגירה ב-500 סל"ד, 25±3℃ למשך שעתיים.
3.הפוך את המיקרו-פליט בכיור והשליך את תמיסת הציפוי.הפיפטה 300μL של PBST 0.05% לתוך כל באר כדי לשטוף את צלחת ELISA ולהשליך את הפתרון, וחזור על הכביסה 3 פעמים.הופכים את הצלחת על מגבת נייר נקייה ומייבשים.
4.הוסף 100μL של מצע TMB (ראה טבלה 1) לכל באר, אטום את צלחת ELISA ודגירה בחושך בטמפרטורה של 25±3℃ למשך 15 דקות.
5.הפיפטה 100μL של תמיסת עצור לתוך כל באר.
6.מדוד ספיגה באורך גל של 450/650 ננומטר עם קורא מיקרו-לוחים.
7.נתח נתונים על ידי SoftMax או תוכנה מקבילה.שרטט עקומה סטנדרטית באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים.
דוגמה לעקומה סטנדרטית
הערה: אם ריכוז HCP בדגימה חורג מהגבול העליון של העקומה הסטנדרטית, יש לדלל אותו כראוי במאגר דילול לפני הבדיקה.
הערות
תמיסת העצירה היא חומצה גופרתית 2M, נא לטפל בזהירות כדי למנוע התזות!
