אנזים מכסת וירוס Vaccinia
אנזים מכסת וירוס Vaccinia מופק מזן E. coli רקומביננטי נושא את הגנים לאנזים Vaccinia cappping.אנזים בודד זה מורכב משתי יחידות משנה (D1 ו-D12) ויש לו שלוש פעילויות אנזימטיות (RNA triphosphatase ו-guanylyltransferase על ידי תת-יחידת D1 ו-guanine methyltransferase על ידי תת-יחידת D12).Vaccinia virus Capping Enzyme יעיל לזרז היווצרות של מבנה כובע, שיכול לצרף באופן ספציפי את מבנה כובע 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) לקצה 5' של RNA.מבנה הכובע (Cap 0) ממלא תפקיד חשוב בייצוב, הובלה ותרגום של mRNA באוקריוטים.כיסוי RNA על ידי תגובה אנזימטית היא שיטה יעילה ופשוטה שיכולה לשפר משמעותית את היציבות והתרגום של RNA עבור שעתוק חוץ גופית, טרנספקציה והזרקת מיקרו.
רכיבים
אנזים מכסה וירוס Vaccinia (10 U/μL)
מאגר 10×Capping
תנאי אחסון
-25～- 15℃ לאחסון （ הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים）
מאגר אחסון
20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 100 מ"מ NaCl,
1 מ"מ DTT, 0. 1 מ"מ EDTA, 0. 1% טריטון X-100, 50% גליצרול.
הגדרת יחידה
יחידה אחת של Vaccinia virus Capping Enzyme מוגדרת ככמות האנזים הדרושה לשילוב 10pmol של GTP בתעתיק של 80nt תוך שעה אחת ב-37°C.
בקרת איכות
Exonuclease:10U של אנזים כיסוי נגיף Vaccinia עם 1μg λ-Hind III עיכול DNA בטמפרטורה של 37 ℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.
אנדונוקלאז:10U של אנזים כיסוי נגיף Vaccinia עם 1μg λDNA ב-37℃ למשך 16 שעות אינו מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
ניקאזה:10U של אנזים כיסוי נגיף Vaccinia עם 1 מיקרוגרם pBR322 בטמפרטורה של 37 ℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
RNase:10U של אנזים כיסוי נגיף Vaccinia עם 1.6 מיקרוגרם MS2 RNA למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37℃ לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
1.coli DNA:10U של Vaccinia virus Capping Enzyme נבדק עבור נוכחות של DNA גנומי מסוג E. coli באמצעות TaqMan qPCR עם פריימרים ספציפיים ל-E. coli 16S rRNA לוקוס.זיהום ה-DNA הגנומי של E. coli הוא ≤1 גנום E. coli.
2.חיידקי אנדוטוקסין: בדיקת LAL, על פי מהדורת פרמקופיה סינית IV 2020, שיטת בדיקת מגבלת ג'ל, כלל כללי (1143).תכולת האנדוטוקסין החיידקית צריכה להיות ≤10 EU/mg.
מערכת תגובה ותנאים
1. פרוטוקול מכסה (נפח תגובה: 20 μL)
הליך זה חל על תגובת המכסה של 10μg RNA (≥100 nt) וניתן להגדיל אותו בהתאם לדרישות הניסוי.
I) שלבו 10μg RNA ו-Nuclease H2O בצינור מיקרופיוג' של 1.5 מ"ל לנפח סופי של 15.0 μL.*10×Capping מאגר: 0.5M Tris-HCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) מחממים ב-65℃ למשך 5 דקות ולאחר מכן אמבט קרח למשך 5 דקות.
3) הוסף את הרכיבים הבאים בסדר שצוין
| Cאמן | Vאולום |
| RNA דנטורטי (≤10 מיקרוגרם, אורך≥100 nt) | 15 μL |
| מאגר 10×Capping* | 2 μL |
| GTP (10 מ"מ) | 1 μL |
| SAM (2 מ"מ) | 1 μL |
| אנזים מכסה וירוס Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
*10×Capping Buffer：0.5M Tris-HCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ה-RNA מכוסה כעת ומוכן ליישומים במורד הזרם.
2. טרמינל 5′ תגובת תיוג (נפח תגובה: 20 μL)
פרוטוקול זה נועד לתייג RNA המכיל טריפוספט 5' וניתן להגדיל אותו בהתאם לדרישות.היעילות של שילוב התווית תושפע מהיחס המולארי של RNA:GTP, כמו גם מתוכן ה-GTP בדגימות RNA.
1) שלבו כמות מתאימה של RNA ו-H2O ללא Nuclease בצינורית מיקרופיוג' של 1.5 מ"ל לנפח סופי של 14.0 μL.
2) מחממים ב-65℃ למשך 5 דקות ולאחר מכן אמבט קרח למשך 5 דקות.
3) הוסף את הרכיבים הבאים בסדר שצוין.
| Cאמן | Vאולום |
| RNA דנטורטי | 14 μL |
| מאגר 10×Capping | 2 μL |
| מיקס GTP** | 2 μL |
| SAM (2 מ"מ) | 1 μL |
| אנזים מכסה וירוס Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX מתייחס ל-GTP ולמספר קטן של סמנים.לריכוז של GTP, עייןלהערה 3.
4) דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, קצה RNA 5' מסומן כעת ומוכן למורד הזרם
יישומים
1. כיסוי mRNA לפני מבחני תרגום/תרגום חוץ גופי
2. תיוג קצה 5 של mRNA
הערות על השימוש
1.חימום תמיסת ה-RNA לפני הדגירה עם אנזים Vaccinia Capping מסיר את המבנה המשני בקצה ה-5 של התמליל.הארך את הזמן ל-60 דקות עבור תמלילים עם קצוות 5 ידועים בעלי מבנה גבוה.
2. יש לטהר RNA המשמש לתגובות מכסה לפני השימוש ולהיות מושעה במים נטולי נוקלאז.EDTA לא אמור להיות קיים והתמיסה צריכה להיות נקייה ממלחים.
3. לתיוג קצה 5', ריכוז ה-GTP הכולל צריך להיות בערך פי 1-3 מהריכוז המולארי של mRNA בתגובה.
4. ניתן להגדיל או להקטין את נפח מערכת התגובה בהתאם למציאות.
