PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) היא השיטה האנזימטית היעילה ביותר להסרת כמעט כל האוליגוסכרידים הקשורים ל-N מגליקופרוטאין.PNGase F הוא amidase, אשר מתפצל בין השאריות הפנימיות ביותר של GlcNAc ואספרגין של אוליגוסכרידים גבוהים של מנוז, היברידיים ומורכבים מ-N-linked glycoproteins.
יישום
אנזים זה שימושי להסרת שאריות פחמימות מחלבונים.
הכנה ומפרט
| מראה חיצוני | נוזל חסר צבע |
| טוהר חלבון | ≥95% (מ-SDS-PAGE) |
| פעילות | ≥500,000 U/mL |
| אקסוגליקוזידאז | לא ניתן לזהות פעילות (ND) |
| אנדוגליקוזידאז F1 | ND |
| אנדוגליקוזידאז F2 | ND |
| אנדוגליקוזידאז F3 | ND |
| אנדוגליקוזידאז H | ND |
| פרוטאז | ND |
נכסים
| מספר EC | 3.5.1.52(רקומביננטי ממיקרואורגניזם) |
| משקל מולקולרי | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| נקודה איזואלקטרית | 8. 14 |
| pH אופטימלי | 7.0-8.0 |
| טמפרטורה אופטימלית | 65 מעלות צלזיוס |
| סגוליות המצע | ביקוע קשרים גליקוזידיים בין GlcNAc ושאריות אספרגין איור 1 |
| אתרי זיהוי | N-linked glycans אלא אם כן מכילים α1-3 fucose איור 2 |
| מפעילים | DTT |
| מעכב | SDS |
| טמפרטורת אחסון | -25 ~-15 ℃ |
| השבתת חום | תערובת תגובה של 20µL המכילה 1µL של PNGase F מושבתת על ידי דגירה ב-75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. |
איור 1 סגוליות המצע של PNGase F
איור 2 זיהוי יושב של PNGase F.
כאשר שיירי ה-GlcNAc הפנימיים מקושרים ל- α1-3 fucose, PNGase F אינו יכול לבקע אוליגוסכרידים מקושרים ל-N מגליקופרוטאין.שינוי זה נפוץ בצמחים ובחלק מהגליקופרוטאינים של חרקים.
Cמתנגדים
|
| רכיבים | ריכוז |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
הגדרת יחידה
יחידה אחת (U) מוגדרת ככמות האנזים הנדרשת כדי להסיר מעל 95% מהפחמימה מ-10 מיקרוגרם של RNase B מפוגג בשעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בנפח תגובה כולל של 10 מיקרוגל.
תנאי תגובה
1. ממיסים 1-20 מיקרוגרם של גליקופרוטאין עם מים מופחתים, הוסף 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer ו-H2O (במידת הצורך) כדי ליצור נפח תגובה כולל של 10 µl.
2.דגירה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מקררים אותו על קרח.
3.הוסף 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 וערבב.
4.הוסף 1-2 μl PNGase F ו-H2O (במידת הצורך) כדי ליצור נפח תגובה כולל של 20 μl ולערבב.
5.דגירה תגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
6.לניתוח SDS-PAGE או ניתוח HPLC.
