mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase נגזר מזן E. coli רקומביננטי הנושא את הגן של vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.אנזים זה מוסיף קבוצת מתיל במיקום 2´-O של הנוקלאוטיד הראשון הסמוך למבנה הכובע בקצה ה-5 של ה-RNA. האנזים משתמש ב-S-adenosylmethionine (SAM) כתורם מתיל כדי למתיל RNA capped (cap) -0) וכתוצאה מכך מבנה cap-1.

מבנה ה-Cap1 יכול להגביר את יעילות התרגום, לשפר את הביטוי של mRNA בניסויי טרנספקציה ומיקרו-הזרקה. אנזים זה דורש באופן ספציפי RNA עם כובע m7GpppN כמצע.זה לא יכול להשתמש ב-RNA עם pN, ppN, pppN או GpppN בקצה ה-5.ניתן להכין RNA Capped באמצעות שעתוק במבחנה באמצעות אנלוגי קאפ או באמצעות מכסה אנזימטי באמצעות אנזים Vaccinia Capping.

רכיבים

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

מאגר תגובה של 10×Capping

אִחסוּן

-25 ～- 15℃ לאחסון （ הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים）

מאגר אחסון

20 mM Tris-HCl (pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% גליצרול.

הגדרת יחידה

יחידה אחת מוגדרת ככמות האנזים הדרושה כדי לבצע מתילציה של 10 pmoles של תמליל RNA עם כיסוי של 80 nt תוך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.

מבחני בקרת איכות

Exonuclease:50U של mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase עם 1μg λ-Hind III עיכול DNA ב-37 ℃ למשך 16 שעות אינו מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.

אנדונוקלאז: 50 U של mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase עם 1 מיקרוגרם λDNA ב-37℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.

ניקאזה: 50U של mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase עם 1μg pBR322 ב-37 ℃ למשך 16 שעות לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.

RNase: 50U של mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase עם 1.6מיקרוגרם MS2 RNA למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37℃ לא מניב פירוק כפי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.

E. coli DNA: 50U של mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase נבדק עבור נוכחות שלE. coli DNA גנומי באמצעות TaqMan qPCR עם פריימרים ספציפיים עבורE. coli מוקד rRNA של 16S.הE. coli זיהום DNA גנומי הוא =1E. coli גנום.

חיידקי אנדוטוקסין: בדיקת LAL, על פי מהדורת פרמקופיה סינית IV 2020, שיטת בדיקת ג'ל, כלל כללי (1143).תכולת האנדוטוקסין החיידקית צריכה להיות =10 EU/mg.

מערכת תגובה ותנאים

1. שלבו כמות מתאימה של Capped RNA ו-RNase H2O ללא RNase בשפופרת מיקרופיוג' בנפח 1.5 מ"ל לנפח סופי של 16.0 μL.

2. מחממים ב-65℃ למשך 5 דקות ולאחר מכן אמבט קרח למשך 5 דקות.

3. הוסף את הרכיבים הבאים בסדר שצוין (עבור מתילציה של Capped RNA

פחות מ 10

*10× מאגר תגובת כיסוי: 500 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl2 、 10 מ"מ DTT.

4. דגירה בטמפרטורה של 37℃ למשך שעה אחת (מומלצת שעתיים של דגירה עבור שבר היעד פחות מ-200 nt).

יישומים

כדי לשפר את ביטוי ה-mRNA במהלך ניסויי מיקרו-הזרקה ו-transfection.

הערות על השימוש

1. לפני התגובה יש לטהר ולהמיס את ה-RNA במים נטולי נוקלאז, כל התמיסות לא צריכות להכיל EDTA ויונים.

2. מומלץ לחמם את ה-RNA המדגם ב-65℃ למשך 5 דקות לפני התגובה כדי להסיר את המבנה המשני בקצה ה-5 של התמליל.ניתן להאריך אותו ל-10 דקות עבור מבנה מורכב של 5 ´-טרמינלים.