RNA דו-גדילי (dsRNA) ELISA KIT

ערכה זו היא צימוד אנזים מקושר אימונוסורבנט (ELISA) עם מערכת ביוטין-סטרפטאווידין, למדידה כמותית של dsRNA באורך מעל 60 זוגות בסיסים (bp), ללא קשר לרצף.הצלחת צופה מראש בנוגדן אנטי-dsRNA.dsRNA הקיים בדגימה מתווסף ונקשר לנוגדנים המצופים על הבארות.ואז מתווסף נוגדן אנטי-dsRNA ביוטיניל ונקשר ל-dsRNA בדגימה.לאחר הכביסה, מוסיפים HRP-Streptavidin ונקשר לנוגדן Biotinylated anti-dsRNA.לאחר הדגירה לא קשור HRP-Streptavidin נשטף.לאחר מכן מוסיפים תמיסת מצע TMB ומזרזת על ידי HRP כדי לייצר מוצר בצבע כחול שהשתנה לצהוב לאחר הוספת תמיסת עצור חומצית.הצפיפות של הצהוב פרופורציונלית לכמות היעד של dsRNA שנלכדה בצלחת.הספיגה נמדדת ב-450 ננומטר.

יישום

ערכה זו מיועדת למדידה כמותית של שיורי dsRNA.

רכיבי ערכה

אחסון ויציבות

1. לערכה שאינה בשימוש: ניתן לאחסן את הערכה כולה ב-2~8℃ בחיי מדף.יש להימנע מאור חזק ליציבות האחסון.

2. לערכה משומשת: לאחר פתיחת ה-microplate, נא לכסות בארות שאינן בשימוש עם אוטם צלחות והחזרו לנרתיק הנייר המכיל את חבילת חומרי היבש, אטום את שקיק הנייר והחזר ל-2~8℃ בהקדם האפשרי לאחר השימוש.יש להחזיר ריאגנטים אחרים ל-2~8℃ בהקדם האפשרי לאחר השימוש.

חומרים נדרשים אך לא מסופקים

1. קורא Microplate עם מסנן 450±10nm (עדיף אם יכול לזהות באורך גל של 450 ו-650 ננומטר).

2. שייקר מיקרופלייט.

3. טיפים ללא RNase וצינורות צנטריפוגות.

תרשים זרימה של מבצע

לפני שאתה מתחיל

1. הבא את כל רכיבי הערכה והדוגמאות לטמפרטורת החדר (18-25℃) לפני השימוש.אם הערכה לא תיוצל בזמן אחד, נא להוציא רק רצועות וריאגנטים לניסוי הנוכחי, ולהשאיר את הרצועות והריאגנטים הנותרים במצב הנדרש.

2. חיץ כביסה: יש לדלל 40 מ"ל של חיץ כביסה מרוכז בגודל 20× עם 760 מ"ל של מים מפושטים או מזוקקים כדי להכין 800 מ"ל של חיץ כביסה 1×.

3. סטנדרטי: סובב או צנטריפוגה קצרות את תמיסת המניות לפני השימוש.הריכוז של ארבעה תקנים שסופקו הוא 5ng/μL.עבור תקני UTP ו-pUTP dsRNA, נא לדלל את תמיסת המניות ל-1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL עם חיץ STE כדי לצייר את העקומה הסטנדרטית.עבור תקני N1-Me-pUTP dsRNA, נא לדלל את תמיסת המניות ל-2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL עם חיץ STE כדי לצייר את העקומה הסטנדרטית.עבור תקן 5-OMe-UTP dsRNA, נא לדלל את תמיסת המניות ל-4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL עם חיץ STE כדי לצייר את העקומה הסטנדרטית.אנו ממליצים שניתן לדלל תקנים כתרשימיים הבאים:

4. נוגדנים לגילוי ביוטיניל ותמיסת עבודה של HRP-streptavidin: סובב או צנטריפוגה קצרות את תמיסת המניות לפני השימוש.לדלל אותם לריכוז העבודה עם חיץ דילול.

5. תת-מצב TMB: שאפו את המינון הדרוש של התמיסה עם קצות מעוקרות ואל תזרקו שוב את שאריות התמיסה לתוך הבקבוקון.מצע TMB רגיש לאור, אל תחשוף מצע TMB לאור לאורך זמן.

שימוש בפרוטוקול

1. קבע את מספר הרצועות הנדרשות לבדיקה.הכנס את הרצועות למסגרות לשימוש.יש לארוז מחדש את רצועות הצלחת הנותרות שלא נעשה בהן שימוש בבדיקה זו בשקית עם חומר יובש.סגור את השקית היטב לאחסון בקירור.

2. הוסף 100μL כל אחד מהדילולים של תקן, ריק ודגימות לבארות המתאימות.מכסים עם אוטם הצלחות.דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-500 סל"ד.יש לדלל את הדגימות במאגר STE לריכוז מתאים לבדיקה מדויקת.

3. שלב השטיפה: שאפו את התמיסה ושטפו עם חיץ כביסה של 250μL לכל באר והניחו לה לעמוד במשך 30 שניות.הסר את חיץ הכביסה לחלוטין על ידי הצמדת הצלחת על נייר סופג.כביסה מלאה 4 פעמים.

4. הוסף 100μL של תמיסת עבודה של נוגדנים לגילוי ביוטיניל לכל באר.מכסים עם אוטם הצלחות.דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-500 סל"ד.

5. חזור על שלב הכביסה.

6. הוסף 100μL של תמיסת עבודה HRP-streptavidin לכל באר.מכסים עם אוטם הצלחות.דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור ב-500 סל"ד.

7. חזור שוב על שלב הכביסה.

8. הוסף 100μL של תמיסת מצע TMB לכל באר.מכסים עם אוטם הצלחות.דגירה במשך 30 דקות ב-RT הגן מפני אור.הנוזל יהפוך לכחול על ידי הוספת תמיסת מצע.

9. הוסף 50μL של תמיסת עצור לכל באר.הנוזל יצהיב על ידי הוספת תמיסת עצור.לאחר מכן הפעל את קורא ה-microplate וערוך מדידה ב-450nm מיד.

חישוב תוצאות

1. ערך ממוצע של הקריאות הכפולות עבור כל תקן, בקרה ודגימות והפחת את הצפיפות האופטית הממוצעת בתקן אפס.בנה עקומה סטנדרטית עם ספיגה בציר האנכי (Y) וריכוז dsRNA בציר האופקי (X).

2. מומלץ לבצע את החישוב עם תוכנת התאמת עקומה מבוססת מחשב כמו curve expert 1.3 או ELISA Calc במודל התאמה לא ליניארי של 5 או 4 פרמטרים.

ביצועים

1. רגישות:

גבול זיהוי תחתון: ≤ 0.001pg/μL (עבור UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (עבור 5-OMe-UTP-dsRNA).

גבול כמות תחתון:0.0156 pg/μL (עבור UTP-, pUTP-dsRNA),0.0312 pg/μL (עבור N1-Me-pUTP-dsRNA),0.0625 pg/μL (עבור 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. דיוק: קורות חיים של Intra-Assay ≤10%, קורות חיים של Inter-Assay ≤10%

3. התאוששות: 80%~120%

4.לינאריות:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(עבור 5-OMe-UTP-dsRNA).

שיקולים

1. טמפרטורת התגובה והזמן של TMB הם קריטיים, נא לשלוט בהם על פי ההוראות בקפדנות.

2. על מנת להשיג שחזור ורגישות בדיקה טובים, שטיפה נכונה של הצלחות כדי להסיר עודפי ריאגנטים שלא הגיבו חיונית.

3. יש לערבב היטב את כל הריאגנטים לפני השימוש ולהימנע מבלבול במהלך הוספה של דגימה או ריאגנטים.

4. אם נוצרו גבישים במאגר הכביסה המרוכז (20x), חממו ל-37℃ וערבבו בעדינות עד להמסה מלאה של הגבישים.

5. הימנע מבדיקת דגימות המכילות נתרן אזיד (NaN3), מכיוון שהוא עלול להרוס את פעילות ה-HRP וכתוצאה מכך להערכת חסר של כמות ה-dsRNA.

6. הימנע מזיהום RNase במהלך הבדיקה.

7. ניתן לבצע את התקן/הדגימה, נוגדן הגילוי ו-SA-HRP גם ב-RT ללא ניעור, אך הדבר עלול לגרום לירידה ברגישות הגילוי פי אחד.במקרה זה, אנו ממליצים לדלל את תקני UTP ו-pUTP dsRNA מ-2pg/μL, יש לדלל את תקני N1-Me-pUTP dsRNA מ-4pg/μL ויש לדלל את תקן 5-OMe-UTP dsRNA מ-8pg/μL.בנוסף, דגירה תמיסת עבודה של HRP-streptavidin למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.אל תשתמש בשייקר בקבוקים, מכיוון שמנער בקבוקים עלול לגרום לתוצאה לא מדויקת.

תוצאה אופיינית

1. נתוני עקומה סטנדרטיים

2. חישוב עקומה סטנדרטית

3. טווח זיהוי אניה: 0.0312- 1pg/μL